文档介绍：该【一种分泌具有纤溶活性蛋白酶的泛温链霉菌c－3662的制作方法 】是由【开心果】上传分享，文档一共【10】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【一种分泌具有纤溶活性蛋白酶的泛温链霉菌c－3662的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。一种分泌具有纤溶活性蛋白酶的泛温链霉菌c-3662的制作方法专利名称:一种分泌具有纤溶活性蛋白酶的泛温链霉菌c-3662的制作方法技术领域:本发明涉及从土壤中筛选得到的一种具有产生纤溶活性蛋白酶CGW-3的泛温链霉菌菌株C-3662。虽然链霉菌种类繁多存在广泛,但是绝大多数链霉菌对人体无害,而且,由于链霉菌是迄今为止发现的绝大多数抗生素的产生菌并广泛地应用于抗生素制药工业,所以链霉菌为提高人类的生活健康水平作出了巨大的贡献。心脑血管血栓栓塞性疾病是一类严重威胁人类健康的疾病,其发病率在人群中仍有逐步上升的趋势。当前,治疗这类疾病的一个有效疗法为溶栓疗法,即对该病患者施用具有溶栓活性的药物,例如尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂等等。这类药物在临床使用中,产生一定的甚至较好的疗效,但同时也存在一些的问题,诸如药物的溶栓特异性还有待提高;这类药物尤其是组织型纤溶酶原激活剂或其衍生物的价格还比较高,有时甚至是难以接受。此外,使用这类药物溶栓,从发生栓塞到给药时的间隔越短,预期疗效也就越好,但是这类药物的给药途径主要为静脉注射,所以带来一定的不方便性。还有一类溶栓药物,它们来源于动物或微生物,具有激活人体中的纤溶酶原活性或直接降解纤维蛋白活性,如链激酶、蛇毒抗栓酶、蚓激酶等,这类药物中有的疗效尚不确切,有的副作用较大,有的在生产原材料的来源上受到一定的限制等。当前研究开发溶栓药物的一个方向是从不同来源的生物尤其是微生物中,筛选提取纤溶酶及纤溶酶原激活剂,以期发现新型溶栓药物。链霉菌既为非致病菌,又产生、分泌多种化合物和/或蛋白质,况且链霉菌具有良好的工业生产基础,所以从链霉菌中筛选并生产人们所需要物质的努力一直持续不断。然而,这种努力的方向似乎主要集中在诸如抗生素、纤维素酶、淀粉酶以及某些种类的蛋白酶的筛选上,对具有纤溶活性的蛋白酶的筛选很少见到报道。显然,从链霉菌中筛选具有产生纤溶活性蛋白酶能力的菌株,是一项值得进行的研究开发工作。法国科学家于1996年报道从一株未定名的链霉菌菌株的发酵液中发现并分离纯化了具有纤溶活性的蛋白酶。中国医学科学院医药生物技术研究所于同年利用自行设计的纤溶物质筛选模型,从云南土壤中筛选得到了产生纤溶活性物质的链霉菌菌株,并从其中的Y405号菌株的发酵液中分离得到了纤溶酶SW-1。后经初步研究发现,SW-1虽然具有良好的溶栓活性,但是同时具有比较明显的出血倾向副作用。本发明的技术方案主要包括以下步骤将待筛选的链霉菌菌株在琼脂平板上培养好后,挖块并分别置于纤维蛋白平板和酪素平板,经37℃保温过夜后,筛选出仅具有纤溶活性的挖块;将对应挖块的链霉菌菌株在发酵培养基中培养;在得到发酵上清液后,经硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析等分离纯化方法处理后,获得纤溶活性蛋白酶CGW-3的纯品。本发明的内容与要点一、链霉菌C-t等琼脂斜面(%、%、牛肉膏、%、%)上,在28℃培养7-10天,然后挖块置于酪素平板(%,%,)和纤维蛋白平板(%,/ml)上,于37℃放置过夜。如果菌株分泌产生对纤维蛋白特异性较高的具纤溶活性蛋白酶,则在纤维蛋白平板上有透明圈,而在酪素平板上没有透明圈。第二天观察平板上透明圈的产生情况,从中筛选在纤维蛋白平板上产生明显的透明圈而在酪素平板上没有或几乎没有透明圈的菌株C-3662。-3662的分类1、形态特征于高氏1号琼脂和葡萄糖天冬素琼脂上28℃培养7天后,菌株C-3662的基内菌丝无横隔、不断裂,孢于丝波曲至螺旋形,孢子椭圆形,表面光滑(图1、2)。2、培养特征选择链霉菌的八种常用的不同营养培养基,在28℃培养7-15天。菌株C-3662的菌丝体在各种不同培养基中的表观特征见表1。3、生理生化特征本发明的菌株C-3662是一种需氧菌,在25-30℃,优选地在28℃显示出最佳生长能力。参照“伯杰氏细菌系统鉴定手册第四卷”(Bergey’sMannualofSystematicBacteriology,),对菌株C-3662进行了生理生化特征鉴定,结果见表2。表1菌株C-3662的培养特征培养基气生菌丝基内菌丝可溶色素高氏合成一号琼脂瓦灰色桂皮淡棕无葡萄糖天门冬素琼脂中灰色无色无甘油***盐琼脂褐灰色芥褐无淀粉铵琼脂浅灰色微褐无苹果酸钙琼脂灰白色浅黄褐无营养琼脂褐灰色污褐浅褐燕麦粉琼脂烬灰色浅黄褐无土豆浸汁琼脂褐灰色浅褐浅褐表2菌株C-3662的生理生化特征1、化学分类(1)细胞壁化学组分分析按照Hasegawa,(TLC)对菌株C-3662进行全细胞水解液的氨基酸及糖型分析。结果表明菌株C-3662含LL-二氨基庚二酸及甘氨酸,无特征性糖(糖型C)。细胞壁化学组分属于I型。(2)按照Lechevalier等的实验方法进行,发现菌株C-3662含磷脂酰乙醇***,磷酸类脂属于II型。2、16SrDNA分析按常规方法提取菌株C-3662的总DNA,采用通用引物进行16SrDNA的PCR扩增,PCR产物经纯化后直接用TaqDyeDeoxyTerminatorCycleSequencingKit测序,电泳及数据分析由AppliedBiosystemsDNASequencer(model377)自动进行。将所测得的16SrDNA序列(图3)与GeneBank数据库中相关种、属的序列进行比较,表明菌株C-3662与泛温链霉菌的16SrDNA序列同源性非常高,%(图4)。根据多相分类定种的原则,综合考虑菌株C-3662的培养特征、生理生化及16SrDNA序列分析比较结果,认为菌株C-3662与泛温链霉菌(Streptomyceseurythermus)非常接近,所以将链霉菌C-3662菌株定名为泛温链霉菌(Streptomyceseurythermus)C-3662。该菌种已于2001年9月11日送交北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,。泛温链霉菌C-3662发酵纤溶酶CGW-3培养基的优化泛温链霉菌C-3662的斜面种子培养基采用本领域公知的合成5号培养基(%,%,%,K2HPO4·%,MgSO4·%,FeSO4·%)。泛温链霉菌C-3662于25-30℃,优选地28℃,在合成5号培养基斜面中培养7-10天,产生丰富的灰色孢子。将斜面种子接种于发酵培养基中,在28℃和pH接近中性的条件下振荡培养3-5天。发酵上清液中的纤溶活性,%,/ml;加样后于37℃保温16h。首先选择了以下6种培养基,进行了发酵培养基组成的初步探索。%、%、%、%、%。%、%、%、%、%、MgSO4·%、%。%、%、%、(NH)%、%、%、%。4号(t)%、%牛肉膏、%。5号(ISP2)%、%、%、%。6号(GGCY)葡萄糖10%、%、%、%、%、CaCl2·%、%、%、Na2HPO4·%。其中的微量元素溶液为ZnCl2·%、FeCl3·%、CuCl2·%、MnCl2·%、Na2B4O7·%、(NH4)6Mo7O2·%。经过发酵,发现2号培养基的发酵上清液纤溶活性最高,其次为3号培养基。以2号和3号培养基中的共同组分黄豆饼粉-淀粉-葡萄糖-磷酸二氢钾-硫酸镁-碳酸钙为基础,进行发酵培养基的优化。%(氮源)、%%(碳源)、%%%(无机盐)为基础,将其发酵上清液中的纤溶活性定为100%,分别固定氮源变换碳源及固定碳源变换氮源,并研究无机盐对发酵产生纤溶活性的影响,结果见表3和表4。综合表3和表4可以看出,%、%、%、%、%、%。本发明所得到的泛温链霉菌C-3662,培养条件简单、保藏方便,在优化的发酵培养基中可分泌产生大量的纤溶活性蛋白酶CGW-3于培养液中,而且CGW-3的分离纯化也比较简单。此外,由于泛温链霉菌C-3662系自然分离菌株,所以经过多次传代后,其大量地分泌产生纤溶活性蛋白酶CGW-3的特性没有退化。由于CGW-3经动物试验后,发现其溶栓效果良好、副作用小,有望开发为一类新的溶栓药物,所以泛温链霉菌C-3662具有潜在的商业应用价值。表3不同氮、碳源培养基对泛温链霉菌C-3662发酵产生纤溶活性的影响表4不同无机盐培养基对泛温链霉菌C-3662发酵产生纤溶活性的影响图1泛温链霉菌C-3662的菌丝体及孢子丝形态(×750)。图2泛温链霉菌C-3662的孢子表面特征(×6000)图3泛温链霉菌C-3662的16SrDNA全序列图4泛温链霉菌C-3662的16SrDNA全序列与GeneBank数据库中的泛温链霉菌16SrDNA全序列的比较,%;图中的Query为链霉菌C-3662的16SrDNA序列,Sbjct为泛温链霉菌的16SrDNA序列。t等琼脂斜面(%、%、牛肉膏、%、%)上,28℃培养10天。然后,从斜面上挖块,分别置于酪素平板(%,%,)和纤维蛋白平板(%,/m1)上,。37℃保温16小时。选出在纤维蛋白平板上产生透明圈,而在酪素平板上不产生透明圈的菌株C-3662。实施例2将在合成5号斜面培养基上28℃培养7天的泛温链霉菌C-3662,挖块接种于装有100毫升培养基(%,%,%,%,%,%,)的500毫升三角瓶中,28℃振荡培养48小时,200转/分钟;然后以5%的接种量转种至装有1000毫升相同培养基的5000毫升三角瓶中,28℃往返振荡培养96小时左右;将发酵液离心或者过滤除去菌丝体,得到上清液,供进一步分离纯化CGW-3使用。实施例3将1升发酵上清液加硫酸铵至80%饱和度,4℃放置过夜,然后8000转/分钟离心10分钟,弃去上清。将沉淀溶于水50毫升中,对50mM磷酸钠()缓冲液透析。将透析后溶液离心以除去不溶物,此时将透析液过DEAESepharose柱(25毫米×200毫米)脱色,接着上CMSepharose柱(25毫米×200毫米),-。混合活性洗脱液,加3MNH4(SO4)2至终浓度为1M,然后上PhenylSepharose柱(15毫米×200毫米),-(SO4)2盐浓度线性梯度洗脱。混合活性洗脱液,用水4℃透析过夜去盐,然后冷冻干燥,得CGW-3纯品。每升发酵上清液得8毫克左右CGW-3纯品,经检测其N-端的15个氨基酸序列为VVGGTRAAQGEFPFM。(Streptomyceseurythermus)菌株C-3662(),其特征是所说的菌株从土壤中分离、筛选并经发酵可产生具有纤溶活性的蛋白酶CGW-3。-3662的筛选方法,其特征是在t等琼脂斜面上得到的培养物,仅在纤维蛋白平板上特异性地产生呈纤溶活性的透明圈,而在酪素平板上不或几乎不产生透明圈。-3662,其特征是葡萄糖-淀粉-黄豆饼粉-无机盐液体培养基中发酵可产生具纤溶活性的蛋白酶CGW-3。的N-端的15个氨基酸为VVGGTRAAQGEFPFM。-3662,其特征是经发酵产生的纤溶活性蛋白酶CGW-3的N-端15个氨基酸序列为VVGGTRAAQGEFPFM。全文摘要本发明涉及一种链霉菌菌株C-3662,它是从土壤中分离得到、经分类鉴定属于泛温链霉菌的链霉菌菌株,其斜面培养物仅在纤维蛋白平板上产生纤溶活性的透明圈,在优化的发酵培养基中能产生并分泌纤溶活性的蛋白酶CGW-3。