1 / 12
文档名称:

一种具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的构建的制作方法.docx

格式:docx   大小:23KB   页数:12页
下载后只包含 1 个 DOCX 格式的文档,没有任何的图纸或源代码,查看文件列表

如果您已付费下载过本站文档,您可以点这里二次下载

分享

预览

一种具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的构建的制作方法.docx

上传人:开心果 2024/5/8 文件大小:23 KB

下载得到文件列表

一种具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的构建的制作方法.docx

相关文档

文档介绍

文档介绍:该【一种具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的构建的制作方法 】是由【开心果】上传分享,文档一共【12】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【一种具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的构建的制作方法 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的构建的制作方法一种具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的构建的制作方法本发明公开了一种具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的构建,属于酶工程领域。通过把酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、烟曲霉纤维素葡聚糖苷酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列按顺序合成,在两端加上限制性内切酶位点,通过酶切构建到pPIC9K质粒中,再将该质粒转化到酵母中得到具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株。其生产纤维素葡聚糖苷酶的回收率达到85%,。本发明实现了纤维素葡聚糖苷酶生产和同步浓缩回收的一步完成,降低了能源消耗,降低了成本,具有较强的实用性。【专利说明】一种具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的构建[0001]【技术领域】[0002]本发明属于酶工程领域,具体涉及一种具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的构建。【背景技术】[0003]纤维素是地球上最丰富的可再生资源,地球上每年因光合作用产生的纤维素达到100亿吨左右,利用纤维素生产生物能源,是缓解能源危机,实现人类可持续发展的关键。[0004]纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类-葡萄糖。纤维素的降解需要外切酶、内切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中葡聚糖苷酶降解葡萄糖的二聚体生产可发酵性的葡萄糖,是纤维素降解的关键步骤。用纤维素酶降解纤维素具有绿色、条件温和、转化率高的特点,但是纤维素较高的生产成本成为纤维素酶降解纤维素的瓶颈。[0005]液体发酵具有发酵体积大,易实现自动化控制等特点,被广泛用来生产纤维素葡聚糖苷酶等。但是液体发酵生产的酶类产品浓度。生产的纤维素葡聚糖苷酶等都游离在发酵醪液中,为得到高浓度的纤维素葡聚糖苷酶或葡聚糖苷酶的固体粉末,需要对发酵醪液进行浓缩。为纯化浓缩纤维素葡聚糖苷酶往往需要通过真空蒸发或喷雾干燥等工艺来浓缩纤。在纤维素蒸发浓缩或喷雾干燥的过程中,纤维素葡聚糖苷酶的活性丧失一部分,而且浓缩工艺大幅度提高了纤维素酶的生产成本。在蒸发或喷雾干燥的过程中,消耗大量的能源如电或燃气等。因此浓缩成本,成为降低液体发酵生产纤维素葡聚糖苷酶生产成本的必然选择。【发明内容】[0006]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株。[0007]本发明的另一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的DN***段。[0008]本发明的再一目的在于提供用于构建上述酵母菌株的质粒。[0009]本发明的目的还在于提供上述酵母菌株的构建方法。[0010]本发明的目的通过下述技术方案实现:用于构建具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的DN***段,包括按顺序排列的酿酒酵母TDH3启动子序列、酿酒酵母分泌信号肽编码序列、烟曲霉纤维素葡聚糖苷酶编码序列、酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸片段编码序列、酿酒酵母TDH3终止子序列;~5所示。[0011]优选的,所述的用于构建具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的DN***。[0012]用于构建具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的质粒为包含上述DN***段的真核表达质粒。所述的真核表达质粒优选为PPIC9K质粒。[0013]所述的用于构建具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的质粒优选通过包含如下步骤的方法制备得到:合成两端有限制性内切酶识别位点含有上述DN***段的序列,通过限制性内切酶连接到真核表达质粒上。所述的真核表达质粒PPIC9K质粒时,限制性内切酶优选为BglII和FspAI。[0014]一种具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株,含有上述质粒。所述的酵母菌株优选为酵母菌株SMDl168。[0015]所述的具有生产和回收纤维素葡聚糖苷酶双重功能的酵母菌株的构建方法,包括如下步骤:制备酵母电转化感受态细胞,将上述质粒通过电转化转进酵母中得到。[0016]本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:本发明的酵母菌株能在生产纤维素葡聚糖苷酶的同时,把纤维素葡聚糖苷酶吸收菌株自身表面,通过简单过滤,就能达到浓缩纤维素葡聚糖苷酶的目的。[0017]本发明大大简化了纤维素葡聚糖苷酶的浓缩工艺,降低了能源消耗,大幅度降低了成本,因此该发明具有较强的实用性。[0018]本发明把烟曲霉纤维素葡聚糖苷酶基因在酵母内表达,并实现了烟曲霉葡聚糖苷酶生产和同步浓缩回收的一步完成,现有未有相关报道,具有较高的创新型。[0019]本发明酵母菌株生产纤纤维素葡聚糖苷酶的回收率达到85%,。`【具体实施方式】[0020]下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。[0021]实施例1(l)pPIC9K质粒的提取I)接1%含PPIC9K质粒的大肠杆菌细胞于2mLLB培养基。[0022]2)37°C振荡培养12h。[0023]3),以4000rpm离心3min,弃上清液。[0024]4)(1%葡萄糖,,25mMTris-)充分混合。[0025]5)(,1%SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5min。[0026]6)(5mol/LKAc,),轻轻翻转混匀,冰浴5min。[0027]7)以10000rpm离心20min,取上清液于另一新EP管中。[0028]8)加入等体积的异戊醇,混匀后静置10min。[0029]9)再以10000rpm离心20min,弃上清。[0030]10)用70%,抽干所有液体。[0031]11)待沉淀干燥后,。[0032](2)大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备I)将大肠杆菌DH5a置于LB或其它营养丰富的培养基上,在37°C下过夜培养。[0033]2)高温灭菌大的离心瓶(250~500mL)以备第二天摇瓶用。[0034]3)准备几瓶灭菌水(),保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。[0035]4)~ImL过夜培养物至装有20mLLB(或其他营养丰富的培养基)的100mL摇瓶。[0036]5)371:下剧烈振荡培养6小时。[0037]6)监控0D600值(培养I小时后每半小时测定一次)。[0038]7)~,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却15分钟。[0039]8)细胞在4V5000g下离心15分钟,弃上清液。[0040]9)用灭菌的冰水重悬浮细胞,先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升),然后加水稀释至离心管的2/3体积。[0041]10)照上面步骤重复离心,小心弃去上清液。[0042]11)照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。[0043]12)离心,弃上清液。[0044]13)用20mL灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞。[0045]14)照上面步骤离心,小心`弃去上清液(沉淀可能会很松散)。[0046]15)用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2~3mL。[0047]16)将细胞按150μL等份装入微量离心管,于-80°C保存。[0048](3)pPIC9K_GLU质粒构建I)用限制性内切酶BglI1、FspAI分别酶切质粒pPIC9K。限制性内切酶BglI1、FspAI(TAkaRA)?,提取的pPIC9K质粒溶液6μ?,IOXKBufferWL加入到100μ?EP管中,在30°C水浴锅中酶切60min。再通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切的质粒pPIC9K。[0049]2)序列合成-酿酒酵母TDH31启动子序列-酿酒酵母分泌信号肽编码序列-烟曲霉纤维素葡聚糖苷酶编码序列-酿酒酵母凝聚因子C端的400个氨基酸编码序列-酿酒酵母TDH3终止子序列-,~6所示。[0050]3)连接合成的碱基序列20μ?,酶切的PPIC9K质粒5μ?,IOXbuffer5μ?,ddH20ΙΟμ?,Τ4DNA连接酶(Takara)5μ?加入100μ?EP管中,16°C连接过夜。[0051]4)将上述连接产物电转化到大肠杆菌DH5α,电转化具体方法如下:)在冰上解冻大肠杆菌DH5α感受态细胞添加I~10μL连接产物,冰上放置约5分钟。[0052])转移连接产物/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器中。[0053])加载电转仪P1000,准备好300yLLB或2XYT。[0054])对电穿孔容器进行脉冲(200欧姆,25μF,),检查时间常数,应该在3以上。[0055])立即添加300μL的LB或2ΧΥΤ至电转杯中。[0056])37°C下培养细胞40分钟至I小时以复苏。[0057])复苏后离心弃掉150μL上清,剩余150μL重悬菌体涂布到含有氨苄(100Kg/mL)的LB或2XYT培养基的固体平板上,于37°C培养过夜。[0058]5)挑去固体平板上生长的单克隆,通过培养,提取质粒,用BglII和FspAI对质粒进行酶切鉴定,鉴定正确的质粒再进一步测序,得到质粒PPIC9K-GLU。[0059](4)酵母感受态细胞的制备1)挑一环酵母菌(SMD1168)接种于5mLYEPD培养基中,30V250~300rpm培养过夜得到一级种子。[0060]2)取ImL—级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中,30V250~300rpm培养约16~18h(~)。[0061]3)于4°C离心收集菌体,用25mL冰预冷无菌水洗涤一次后,细胞用10mL冰预冷无菌水重悬,可换成较小的离心管。[0062]4),摇晃均匀,再加入1mLIOXLiAc,旋转摇匀,于301:轻轻摇动45min。[0063]5),并同时旋转摇动,于30°〇轻轻摇动15min。[0064]6)于4°C离心,弃上清(用枪吸),再用25mL冰预冷无菌水洗涤。[0065]7),离心收集菌体,弃上清(用枪吸)。[0066]8)每管用100μLImol/L山梨醇溶解,分装管中(80μL/管),于_70°C冰箱保存。[0067](5)pPIC9K-GLU质粒电转化酵母I)向酵母感受态细胞中加入约5~10μg(体积小于10μL)pPIC9K-GLU质粒,用枪吹吸均匀,转移至预冷的电转杯中,静置5min。[0068]2)擦干电转杯,电击,电击参数:,25yF,200欧姆。[0069]3)立即加入ImL冰预冷的Imol/L山梨醇,转移至离心管中,于30°C静置lh。[0070]4)离心,弃上清,加入ImLYEPD后,于30°C>200rpm培养2h。[0071]5)离心得菌体后,吸除550μL上清液,然后取150μL涂100Pg/mL氨苄YETO板于30°C培养至长出转化子。[0072](6)酵母转化子发酵挑取的转化子在YEro培养基中30°C培养24h,以10%接种量(v/v)接种于发酵培养基(酵母浸膏10g/L,蛋白胨20g/L,50mM柠檬酸缓冲液,麸皮200g/L,羟***纤维素20g/L,lL水)中。发酵在500mL摇瓶中发酵,装液量为20%(v/v)。在发酵培养基中培48h0[0073](7)纤维素葡聚糖苷酶的回收发酵液在离心机中4000r/m离心10min,收集上清(上清中有游离的葡聚糖苷酶,用于纤维素葡聚糖苷酶回收率的计算),按酵母沉淀湿重与蒸馏水质量比1:10的比例加入蒸馏水,用蒸馏水洗涤两次,收集酵母沉淀,纤维素葡聚糖苷酶固定在酵母表面。[0074]葡聚糖苷酶酶活测定:以水杨苷底物,在50°C进行酶降解反应。在25mL试管中加入10mL含有20g/(),,在水浴锅中50°C保温30min,然后用沸水煮沸5min。用DNS法测定还原糖的含量。[0075]酶活定义为:每分钟释放出IMmol还原糖所需要的酶量。[0076]葡聚糖苷酶回收率(%)=酵母沉淀的酶活/(上清液的酶活+酵母沉淀的酶活)X100%O