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-异戊醇(24:1),轻轻混匀,0℃冰浴20min(加5倍体积裂解缓冲液Ⅱ溶解沉淀以提取DNA)。5、12000r/min,4℃离心15min。6、取上清,加入等体积冰浴冷却的异丙醇,混匀且冰浴10min。7、5000r/min,4℃离心10min。%的SDS缓冲液中,加入8mil/,冰浴4℃过夜。8、12000r/min,4℃离心10min。9、70%乙醇洗涤沉淀两次,空气干燥10min后,溶于DE-PC处理的TE或水中。加入1/10体积10%重复第四、六步进一步除去蛋白质。-70℃冰箱保存。裂解缓冲液Ⅰ成分:7mol/L尿素,50mmol/LTris-,10mmol/LNa2EDTA,,,%,%SDS+%LDS。裂解缓冲液Ⅱ成分:7mol/L尿素,50mmol/LTris-,10mmol/LNa2EDTA,,,%,%SDS+1%LDS。(二)植物总RNA的提取(百度文库)--5:..精选文库Trizol试剂是由苯酚和硫***酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂,在匀浆和裂解过程中,能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。在***仿抽提、离心分离后,RNA处于水相中,将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。Trizol试剂配制苯酚饱和液(38%)-380ml/l、硫***酸胍盐(-)、硫***酸铵()--、醋酸钠pH5()-、甘油–50ml,加水至1L实验试剂1、无RNA酶的无菌水:用将高温烘烤的玻璃瓶(180℃2小时)装蒸馏水,%的DEPC(体积/体积),处理过夜后高压灭菌。2、75%乙醇:用DEPC处理水配制75%乙醇,(用高温灭菌器皿配制),然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱。3、***仿:异戊醇[24:1(v/v)]、***仿。4、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇。5、Trizol试剂。操作步骤1、取植物嫩叶,液氮研磨,;,迅速混匀,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。3、室温下静置5~10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离4、***仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒,室温静置5分钟5、10000r/min离心10分钟6、取上清液(水相)转入一新的离心管,加入等体积异丙醇,室温放置10分钟,10000r/min离心10分钟。7、弃去上清液,加入至少1ml的70%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500r/min离心5分钟。8、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于TE或DEPC处理过的水中,必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃(三)CTAB方法提取植物叶片RNA(百度文库)操作步骤1、取叶片材料两克,液氮中研磨成细粉末。2、每管加入10ml65℃预热的CTAB提取液和500μlβ-巯基乙醇,剧烈涡旋匀浆,65℃水浴温育30min。3、每管加入10ml***仿:异戊醇(24:1),涡旋混匀,冰浴10min。4℃,12000rpm离心10min。4、取上清,加入1∕3体积的8MLiCl和500μlβ-巯基乙醇,-20℃沉淀过夜。5、4℃,12000rpm离心20min。6、弃上清,沉淀用4ml异硫***酸胍变性液溶解,加入120μlβ-巯基乙醇和880μl2MNaAc(),混匀后加入5ml的酚:***仿:异戊醇(25:24:1),涡旋混匀,冰浴5min。4℃,12000rpm离心10min。7、取上清,加入等体积酚:***仿:异戊醇(25:24:1),涡旋混匀,冰浴5min。4℃,--6:..精选文库12000rpm离心10min。8、取上清,加入等体积***仿:异戊醇(24:1),涡旋混匀,冰浴5min。4℃,12000rpm离心10min。9、取上清,加入1∕10体积的3MNaAc(),-20℃放置过夜。10、4℃,14000rpm离心20min。弃上清,沉淀用预冷的75%乙醇漂洗2次,每次洗涤后,14000rpm离心10min,弃上清。冰上干燥RNA沉淀。11、加入100μlRNase-free-ddHO溶解沉淀。取10μl稀释200倍检测UVλ230、260、2280下的OD值,检测RNA样品的纯度与浓度。取5μg进行RNA样品的电泳检测,以检测rRNA的完整性,其余样品加入3倍体积的无水乙醇于-70℃下保存。(四)硅藻土-苯酚法(一种广泛适用的RNA提取方法)(来自李晓宇的方法)利用硅藻土能够有效吸附RNA酶的特性,结合高盐、PVP及乙二醇丁醚沉淀等过程,,可以从富含RNase及多糖、多酚等代谢产物提取RNA困难的动、植物及微生物材料中提取高质量总RNA植物组织RNA提取的难点及对策。具体步骤:(全过程均在冰上操作,保持样品温度在0~4℃)1、样品液氮速冻,于研钵中研磨成细微粉末并转入预冷的离心管;2、按照4ml/g的比例加入硅藻土提取缓冲液,充分震荡后加入1/2体积的水饱和酚和1/2体积的***仿∶异戊醇(24∶1),震荡混匀;3、4℃12000g离心10min,取上清加入等体积5mol/LKAc(),混匀后冰浴10min;4、4℃13000g离心10min,液相转入新管,重复上述酚仿抽提,直至界面清亮;5、上清移入新管,加入等体积乙二醇丁醚,混合均匀后,冰上放置1h;6、4℃14000g离心15min,沉淀用75%乙醇洗2次,空气干燥后用适量DEPC-HO溶2解,-70℃保存。硅藻土提取缓冲液:20mmol/L柠檬酸钠(),10mmol/LEDTA,%SDS,1%β-巯基乙醇,100mmol/LNaCl,。(121℃高压灭菌20min,冷却后再加入1%β-巯基乙醇,4℃保存)。硅藻土的处理:5g硅藻土用50ml50mmol/LTris-HCl()溶解,于100℃放置5min。室温2500g离心5min。弃上清,沉淀用40ml50mmol/LTris-HCl()重悬。重复离心和重悬的步骤两次。超声1min。室温3500g离心15min.。沉淀用30ml50mmol/LTris-HCl()重悬。4℃储存。--7:..精选文库实验二:PCR及QPCR普通的PCR是进行定性分析的,而QPCR是进行定量分析的,是检测初始量的,并且在进行PCR是标准曲线的制作是非常重要的。一、PCRPCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。(一)PCR的原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。(二)PCR反应体系(百度文库)10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物200μl引物10~~+、无Mg2buffer:由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值,使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度,但不能超过50mmol/L,否则会抑制DNA聚合酶活性。2、Mg2:~,其对应dNTP为200μmol/L,注意Mg2与dNTPs之间的浓度关系,由于dNTP与Taq酶竟争Mg2,当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。其浓度越小,酶的特异性就越高。3、BSA:一般用乙酰化的BSA,起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用,对Taq酶有保护作用。4、底物(dNTPs):dNTPs具有较强酸性,~,一般存储浓度为10mmol/L,各成份以等当量配制,反应终浓度为20~200μmol/L。高浓度可加速反应,但同时增加错误掺入和实验成本;低浓度可提高精确性,而反应速度会降低。5、Taq酶:能耐95℃高温而不失活,~,最适温度为75~80℃,一般用72℃。能催化以DNA单链为模板,以碱基互补原则为基础,按5’→3’方向逐个--8:..精选文库将dNTP分子连接到引物的3’端,合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。6、模板:不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在,如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高,否则扩增可能不会成功,在此情况下可适当稀释模板。7、引物:~,浓度过高会引起错配和非特异扩增,浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15~30个碱基,引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对,末位碱基最好选用A、C、G(因T错配也能引发链的延伸)。(三)PCR引物设计(百度百科)PCR反应中有两条引物,即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上游的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。引物设计的基本原则:①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。②引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。③引物内部不应出现互补序列。④两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3′端的互补重叠。⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。⑥引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是G和C。⑦引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、***标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。(四)PCR的步骤(百度文库)PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:第一步、模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;第二步、模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;第三步、引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链;重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。(八)PCR的种类(百度文库)种类原理备注反向PCR(Inverse反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种该方法的不足是:①需要从PCR,IPCR),,进行酶切才能得到合理大--9:..精选文库用一对与已知序列两端特异性结合的引小的DN***段。这种选择不物,扩增夹在中间的未知序列。该扩增产能在非酶切位点切断靶物是线性的DN***段,大小取决于上述限制DNA。②大多数有核基因组性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的含有大量中度和高度重复酶切位点分布情况。用不同的限制性内切序列,而在YAC或Cosmid中酶消化,可以得到大小不同的模板DNA,再的未知功能序列中有时也通过反向PCR获得未知片段。会有这些序列,这样,通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。锚定PCR(Anchored用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端应用:它可用于扩增未知或PCR,APCR)技术加上一段已知序列,然后以此序列为引物全知序列,如未知cDNA的制结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR。备及低丰度cDNA文库的构建。不对称两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称应用:可制备单链DN***段PCR(asymmetricPCR)不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物用于序列分析或核酸杂交的技术浓度,常用50~100÷1比例。在最初的探针。10~15个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。反转录PCR(reverse当扩增模板为RNA时,需先通过反转录酶RT-PCR应用非常广泛,无transcription,RT-将其反转录为cDNA才能进行扩增。论是分子生物学还是临床检PCR)技术验等都经常采用。修饰引物PCR技术为达到某些特殊应用目的,如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等,可在引物的5’-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等。巢式PCR(NESTPCR)技先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板主要用于极少量DNA模板的术量,然后再用一对内引物扩增以得到特异扩增。的PCR带,此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些,且用量较少,同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度,这样在第一次PCR时,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合,故只有外引物扩增产物,经过若干次循环,待外引物基本消耗尽,无需取出第一次PCR产物,只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤,同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR(drop-in,drop-outPCR)。--10:..精选文库等位基因特异性PCR技ASPCR依赖于引物3’-端的一个碱基错这样有点突变的模板进行术配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低PCR扩增后