文档介绍：该【大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 】是由【业精于勤】上传分享，文档一共【16】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。【实验原理】在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,penentcells)。1大肠杆菌感受态细胞的制备与转化2024/5/9转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。其原理是细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细菌表面,经42℃短时间热激处理,促进细胞吸收DNA复合物。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。2大肠杆菌感受态细胞的制备与转化2024/5/9转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和***化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法,简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年)。3大肠杆菌感受态细胞的制备与转化2024/5/,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUCm-T质粒(T-载体)共保温,实现转化。由于pUCm-T质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr),可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUCm-T,则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了pUCmT。转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。4大肠杆菌感受态细胞的制备与转化2024/5/9【设备、材料与试剂】一、设备 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪。二、材料 :Rˉ,Mˉ,Ampˉ;pUCmT质粒DNA:购自上海生工生物工程有限公司。5大肠杆菌感受态细胞的制备与转化2024/5/9三、 【实验步骤】一、受体菌的培养 ,接种于20mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37℃振荡培养1-2小时至OD600=。7大肠杆菌感受态细胞的制备与转化2024/5/9二、感受态细胞的制备(CaCl2法) 1、将培养液转入离心管中,冰上放置10-30分钟,然后于4℃下5000rpm离心10分钟。2、弃上清,,冰上放置10分钟后,4℃下5000rpm离心10分钟,弃去上清。3、,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。8大肠杆菌感受态细胞的制备与转化2024/5/9三、转化 1、取200μl感受态细胞悬液,转移至无菌的微量离心管中,置冰上。 2、加入连接产物10μl,轻轻摇匀,冰上放置60分钟。 3、42℃水浴中热击2分钟,热激后迅速置于冰上冷却2分钟。 4、向管中加入800μlSOC液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养30分钟,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。(其间可以将IPTG7μl和X-Gal40μl涂布于预制的Amp平板上)。9大肠杆菌感受态细胞的制备与转化2024/5/95、将上述菌液以3000rpm离心20秒,弃大部分上清,用剩余的100μl上清重悬菌体,涂布于含Amp的筛选平板上(已涂布IPTG7μl和X-Gal40μl),正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 同时做两个对照: 对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。10大肠杆菌感受态细胞的制备与转化2024/5/9