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根据《药品注册管理办法》要求,对于动物源性工艺有效步骤有效去除和/或灭活作用;对于通过单克隆抗体重组生物制品,在工艺上要进行病毒去真核细胞表达的生物制品,要求至少有一个工艺有除/灭活验证。按病毒去除/灭活[1-2]方式的不同,效步骤,能够有效去除和/或灭活非脂包膜病毒[7]。清除病毒的方法可分为膜过滤法[3]、色谱法[4-5]、超对于低pH值病毒灭活工艺,非特异模型病毒建议短时微波加热法、巴氏消毒法、干热法、有机溶剂/选择有包膜的、对理化条件耐受能力强且耐受范围去污剂(S/D)法和低pH值孵放法[6]。《生物组织广的病毒种类,如伪狂犬病病毒;对于纳米膜的过提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价滤工艺,建议选择粒径小的病毒种类,如鼠细小病技术审评一般原则》(下文简称《一般原则》)中要毒。另外,对病毒去除/灭活的验证要注意工艺过求,验证研究的目的是为了获取充足的试验研究数程对样品质量的影响。应考察在工艺处理前后,纯据以证明生产工艺中是否包含有效的病毒去除/灭度、蛋白质含量、蛋白质回收率等的差异或变化能活工艺步骤。《一般原则》要求生产工艺中必须包否确保产品符合质量标准规定。只有在确保工艺含病毒去除/灭活的有效工艺步骤,若不包含,则应处理前后上述质量指标的差异或变化不明显,才能根据不同品种的特点增加相应的处理方法,并不得认为设定的病毒去除/灭活工艺条件是有效的。在改变制品原有的质量。对于从生物组织中提取制工艺验证中,应采用大生产工艺参数中的最差条件成的生物制品,在工艺上应有2个有效工艺步骤从在小试生产规模下进行。如在开展低pH值法灭活机制上进行互补,对于非脂包膜病毒,应不少于1个病毒验证时,采用实际生产pH值、蛋白含量标准规定的最高限与温度范围最低限。在进行膜过滤去收稿日期:2020-03-31除病毒的效果验证时,采用实际生产压力和上样量作者简介:邵顺儒(1971—),男,江苏淮安人,主管药师、执业药师,主[8]范围的上限。按照《一般原则》规定,本试验建立要从事药品生产质量管理、质量控制及研究工作。E-mail:了注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆shaoshunru@。抗体(简称“注射用坏死因子抗体”)膜过滤病毒去通信作者:杨冬芝,博士,教授,硕士生导师,主要从事药物分析研究工作。E-mail:******@xzhmu.。除工艺和低pH值孵放病毒灭活工艺,前者选取小:..—78—江苏农业科学 2020年第48卷第15期小鼠微小病毒、呼肠孤病毒作为指的密度加入96孔细胞培养板中,;在示病毒,后者选取小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒作37℃培养箱中培养24h,设二氧化碳含量为5%,为指示病毒,分别进行去除灭活工艺验证,本试验待细胞铺满后,将各对照及处理后的样品进行连续结果可为该单抗制品的病毒安全性研究提供参考。稀释,稀释倍数为10-1~10-11;在细胞培养板的第1列至第11列加入稀释10-1~10-11倍的病毒 ;在第12列加入细胞培养基, 对照;将上述培养板放进温度为37℃、含5%,每天观察、记录病变细胞数(孔),(其中TCID表示半数组织培养感染剂量),细胞对照孔内的细胞无法维持正常形态,采用96孔50用猫星形胶质细胞进行培养;小鼠微小病毒的起始细胞病变法进行病毒滴定,,用小鼠皮下结缔组血病病毒滴度。(2)选用小鼠微小病毒作为指示病50织细胞进行培养;呼肠孤病毒的起始滴度为毒。培养用细胞为小鼠皮下结缔组织细胞,,用幼仓鼠肾细胞进行培小鼠白血病病毒同样的方法计算小鼠微小病毒滴50养;。(3)选用呼肠孤病毒作为指示病毒。,用猪肾细胞进行培养。上述病毒及细胞均胞为幼仓鼠肾细胞,采用与小鼠白血病病毒相同的由中国食品药品检定研究院保存。方法计算呼肠孤病毒滴度。 病毒去除效果的验证取批号为008-该注射用坏死因子抗体样品由泰州迈博太科201702、008-201703、008-201704的纯化工艺中药业有限公司制备,其中纳米膜过滤病毒去除工艺疏水层析收集的样品各280mL以上,分别进行预过所用注射用坏死因子抗体样品为纯化工艺中通过滤,取预过滤后的样品按照2%的比例加入指示病疏水层析收集的样品,批号分别为008-201702、毒,混匀,采用设置的膜去除病毒工艺过滤上样液,008-201703、008-201704。pH值法灭活病毒工艺分别在膜过滤体积为200、240mL及过滤终点取样,所用样品为亲和层析收集的样品,批号分别为进行残余病毒滴度的检测,检测方法同小鼠白血病cCC-C-20170321、008-201704。病毒。每种指示病毒均用每批上样液测试2次。 病毒灭活工艺的建立采用亲和层析收集(型号为ViresolvePrefilter)和除病毒过滤膜(型号样品,-C-20170321、为ViresolvePro)均购自美国Millipore公司。取纯008-201704,每批样品分别用25mmol/L柠檬酸酸化工艺中疏水层析收集批号分别为008-201702、盐(~)或1mol/LTris-base调节008-201703、008-201704的样品,,于18℃、、ViresolvePrefilter预过滤和ViresolvePro除病毒过20、,用1mol/LTris-base调节pH值至滤膜(,过滤压力为中性。220kPa)过滤,每个病毒、 灭活病毒的工艺对分子排阻色谱纯度、蛋白280mL以上。质含量影响的检测取低pH值孵放前后的样品, 分子排阻色谱纯度、蛋白质回收率的检测用HPLC方法检测分子排阻色谱纯度,再通过紫外考察膜过滤去除病毒工艺对过滤前后样品分子排分光光度法检测蛋白质含量。阻色谱纯度、蛋白质总量的影响。 灭活病毒的工艺效果验证样品,用高效液相色谱(HPLC) 病毒的滴定选用小鼠白血病病毒、伪狂色谱纯度,根据膜过滤前后的总蛋白质量计算蛋白犬病毒作为指示病毒,小鼠白血病病毒用猫星形胶质的回收率。质细胞培养,伪狂犬病毒用猪肾细胞培养, 膜过滤病毒去除工艺的效果验证法同“”节, 病毒的滴定(1)选用小鼠白血病病毒及伪狂犬病毒的滴度。为指示病毒。将猫星形胶质细胞以6×104个/ 病毒灭活效果的验证-:..江苏农业科学 2020年第48卷第15期—79—-20170321、008-201704亲和层析伪狂犬病毒)混匀,于18℃放置4h,、收集的样品,用1mol/LTris-base调节pH值至中10、、,用1mol/LTris-base调节pH性,制备对照样品。,加入值至中性,除菌过滤后作为处理后样品。,使病毒的最终占比为2%,制备病毒照、病毒对照、零点对照、终点对照及处理后样品在对照样品。-C-处理结束后立即冻存于-70℃下,样品滴定时于室20170321、008-201704亲和层析收集的样品,用温复溶。具体方法同“”节,分别滴定并计算1mol/LTris-base调节pH值至中性,按照2%的比小鼠白血病病毒及伪狂犬病毒的滴度,(小鼠白血病病毒、毒均用每批的上样液测试2次。伪狂犬病毒),混匀后除菌过滤,取出2mL并冻存 于-70℃环境下,作为零点对照样品;再取出2mL并于18℃放置4h,冻存于-70℃环境下, 点对照样品。 膜过滤对蛋白质回收率及分子排阻色谱纯-C-20170321、度的影响由表1可以看出,膜过滤去除病毒工艺008-201704亲和层析收集的样品,每批分别用处理的蛋白质回收率均在98%以上,膜过滤前后分25mmol/L柠檬酸盐(~)或子排阻色谱纯度均在98%以上,表明膜过滤后回收1mol/LTris-,按照2%的比率较高,膜过滤对纯度基本无影响,(小鼠白血病病毒、去除病毒的工艺是可行的。表1 膜过滤后的蛋白质收率及膜过滤前后的分子排阻色谱纯度膜过滤后的蛋白质回收率分子排阻色谱纯度(%)样品批号(%)膜过滤前膜过滤后008--- 由表2可以看出,当滤出液体积达280mL影响。(008-201702)、(008-201703)、 (008-201704)时,样品的小鼠微小病毒果从表6可以看出,、、-C-5001mL,均>4lgTCID/。由表3可以看20170321、008-201704的小鼠白血病病毒下降滴50出,当滤出液体积达280mL(008-201702)、、、,50(008-201703)、271mL(008-201704)时,样品的均>4lgTCID/。由表7可以看出,、、4-TCID/,均>4lgTCID/。C-20170321、008-201704的伪狂犬5050以看出,(008-201702)、、、(008-201703)、(008-201704)TCID/,均4lgTCID/,随着处理5050时,、时间的延长,指示病毒小鼠白血病病毒、、,均>4lgTCID/毒的下降滴度不再改变,均≥4lgTCID/,,过滤后的样品符合《一般原则》的要求,表符合《一般原则》的要求,表明该工艺可有效灭活明该工艺可有效去除病毒。病毒。 病毒灭活工艺的建立及验证3 低pH值孵放对蛋白质含量及分子排阻色谱纯度的影响从表5可看出,低pH值孵放在病在建立去除病毒的工艺中,应考察预过滤膜毒灭活前后对样品蛋白质含量及纯度均无明显(型号为ViresolvePrefilter)和除病毒过滤膜(型号:..—80—江苏农业科学 2020年第48卷第15期 膜过滤对小鼠微小病毒的去除效果残余小鼠微小病毒滴度(gTCID/)50试验条件类别008-201702008-201703008-≤≤≤≤≤≥≥≥≥≥≥≤≤≤≥≥≥≥-201702过滤后280mL、008-201703过滤处理后样品≤≤≤、008-≥≥≥≥≥≥≤≤≤≥≥≥≥≥≥ 注:病毒去除数值(降低量)为零点对照样本检测值与去除工艺处理后样本检测值的差。表3、表4同。表3 膜过滤对呼肠孤病毒的去除效果残余呼肠孤病毒滴度(lgTCID/)50组别试验条件类别008-201702008-201703008-≤≤≤≤≤≤≥≥≥≥≤≤≤≥≥≥≥-201702过滤后280mL、008-201703过滤处理后样品≤≤≤、008-201704过滤后271mL病毒降低量≥≥≥≥≤≤≤≥≥≥≥)对上样液中病毒的去除效果、过滤ViresolvePrefilter,除病毒过滤膜型号为Viresolve时的压力、恒压载量试验,分析该过滤膜在完全堵Pro,压力为220kPa。试验结果表明,采用膜过滤工塞前所能过滤的最大上样体积。本试验初步设定艺去除病毒符合工艺需求,该去除病毒工艺的方法了如下除病毒的工艺参数:预过滤膜型号为可行。膜过滤去除病毒的效果验证试验结果表明,:..江苏农业科学 2020年第48卷第15期—81— 膜过滤对小鼠白血病病毒的去除效果残余小鼠白血病病毒滴度(gTCID/)试验条件类别50008-201702008-201703008-≤≤≤≤≤≥≥≥≥≤≤≤≥≥≥≥-、008-201703处理后样品≤≤≤、008-≥≥≥≥≤≤≤≥≥≥≥ 低pH值孵放灭活对样品蛋白质含量及纯度的影响除病毒过滤膜(ViresolvePro)的孔径为20nm,选择蛋白含量(mg/mL)分子排阻色谱纯度(%)的指示病毒小鼠微小病毒粒径为20~26nm,可见样品批号灭活前灭活后灭活前灭活后小鼠微小病毒对去除病毒效果具有有效的指示作cCC-。用3批注射用坏死因子抗体样品进行病毒去除cCC-,结果表明,至滤出终点时,小鼠微小病毒008->4lgTCID/,符合《一般50表6 低pH值孵放对小鼠白血病病毒的灭活效果残余小鼠白血病病毒滴度(lgTCID/)50组别试验条件类别cCC--20170321008-≤≤≤≤≤≤≥≥≥≥≤≤≤≥≥≥≥≤≤≤≥≥≥≥≤≤≤≥≥≥≥ 注:病毒降低量为零点对照样本检测值与灭活工艺后样本检测值的差。表7同。:..—82—江苏农业科学 2020年第48卷第15期 低pH值孵放对伪狂犬病毒的灭活效果残余伪狂犬病毒滴度(gTCID/)50试验条件类别cCC--20170321008-≤≤≤≤≤≥≥≥≥≤≤≤≥≥≥≥≤≤≤≥≥≥≥≤≤≤≥≥≥≥》的要求,证明膜过滤工艺可有效去除小鼠微去除/灭活病毒的理想方法有2个特性:可以部小病毒,此外,注射用坏死因子抗体最大上样液过分去除病毒或者破坏病毒的活性和结构,维持生物滤体积可以达到270mL,能够满足实际生产需要。制品的生物活性、理化性质。病毒去除/灭活工艺本试验结果还表明,用低pH值()处理亲和的验证研究是为了取得充分的试验数据,确认去层析收集样品生产工艺对产品的蛋白质含量及分除/灭活病毒的工艺步骤是否有效。验证的单克隆子排阻色谱纯度均不会产生影响。将3批亲和层析抗体应至少包含1个有效的病毒去除/灭活工艺步收集的样品用于灭活病毒的工艺验证,结果显示,骤,并能有效去除和/或灭活非脂包膜病毒。、室温为18℃,试验样品进行病毒去除/灭活工艺验证结果表明,指示病毒小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒滴度下降值经过膜过滤,蛋白质回收率符合规定,分子排阻色谱均>4lgTCID/,符合《一般原则》的要求,纯度没有明显变化;用低pH值处理后,蛋白质含量、50表明该pH值法在生产过程中可有效灭活病毒。分子排阻色谱纯度无明显变化。在去除/灭活病毒的在单克隆抗体的生产工艺中,可依据蛋白质产验证工艺中,选用的小鼠白血病病毒、小鼠微小病毒、物与病毒颗粒大小的不同,利用膜过滤工艺有效去呼肠孤病毒、伪狂犬病毒这4个病毒的理化性质(病除病毒,在生产中使用一次性除病毒膜包,每次使毒的大小、核酸类型、有无包膜)有代表性,本试验结用后进行完整性测试。该方法已经在国内外多种果显示,经去除或灭活后,小鼠白血病病毒、小鼠微小生物制品的生产中得到了广泛运用[9]。只有病毒病毒、呼肠孤病毒、伪狂犬病毒这4种病毒的滴度下的有效直径大于滤膜的孔径,膜过滤法才能有效截降值均达到了规定的标准(>4lgTCID/),50留病毒,达到去除病毒的目的,这种方法须要与前证明本试验建立的注射用坏死因子抗体病毒去除/灭文所述方法[1]联合使用才能起到有效去除/灭活病活工艺所用方法是有效的。毒的作用。低pH值孵放法是破坏病毒包膜的完整参考文献:性、阻断病毒与宿主受体结合的途径,使病毒无法感染宿主细胞[10-11],起到灭活病毒的作用。低pH[1][M].:科学出版社,2007:237-、经济实惠、容易操作等特[2]-reflectingonthe点,已被用于伪狂犬病毒[10]、猪细小病毒[12]、流感present,projectingtothefuture[J].CurrentOpinionin病毒[13]等病毒的灭活。Biotechnology,2018,53:137-143.:..江苏农业科学 2020年第48卷第15期—83—田旭平,[J].江苏农业科学,2020,48(15):83-:.1002-,李倩(山西农业大学林学院,山西太谷030801) 为了提高基因的表达效率,利用叶绿体基因工程提高美国红的重要特性,。结果表明,美国红腀叶绿体基因组密码子的GC含量依次为GC(%)>GC(%)>GC(%);有效密码子数(ENC)~,123其中ENC值>45的有34个;RSCU>1的密码子有29个,其中14个以U结尾、12个以A结尾,表明其偏好以A、U结尾,且偏倚很弱。中性点图分析表明,,回归系数为-,相关性不显著;美国123红腀叶绿体基因组的GC含量是高度保守的,密码子偏好主要受环境选择的影响;17个密码子被确定最优密码子。本研究为美国红腀叶绿体遗传工程和遗传多样性分析提供了科学依据。 关键词:美国红腀;叶绿体基因组;密码子偏好性;选择 中图分类号: 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2020)15-0083-06 美国红腀(raxinuspennsylvanica)是木犀科在生物体传递遗传信息的过程中,作为联结核(Oleaceae)腀属(Fraxinus)乔木,原产美国,雌雄异酸和蛋白质的密码子扮演着重要的角色[2],密码子株,花先叶开放,喜光、抗寒、抗盐碱、抗水湿,是我被称为第二套遗传密码[3];密码子使用的选择方式国重要的行道树或庭园绿化树种[1]。不仅影响基因的表达[4],也影响基因相应的功能[5]。构成基因组的4种核苷酸可形成64种密码收稿日期:2020-02-17子,各密码子与氨基酸相对应,除甲硫氨酸和色氨基金项目:山西农业大学动植物育种基金(编号:2019yz004)。酸外,其余18种氨基酸均有2~6个密码子,这些编作者简介:柳燕杰(1995—),男,山西吕梁人,硕士研究生,主要从事码同一氨基酸的不同密码子被称为同义密码子园林植物与观赏园艺。(synonymouscodon)[6];在翻译过程中,每个氨基酸通信作者:田旭平,副教授,研究生导师,主要从事园林植物与景观设计。E-mail:txp8638@。相对应同义密码子的使用频率存在差异,即有的同]SinghN,ArunkumarA,PeckM,. hybridfilterstoenabletwo-steppurificationofbiologics[J].[9]郑丰平,王炳,郑琪,-Austin,2017,9(2):350-[J].中国生物制品学杂志,[4]ChiangMJ,PagkaliwanganM,LuteS,,25(12):1712-1713,[10]JohnstonA,UrenE,JohnstonD,,caprylateincubationchromatographysetting[J].BiotechnologyandBioengineering,asasecondviralinactivationstepinthemanufactureofalbumin2019,116(9):2292-[J].Biologicals,2003,31(3):[5]AngeloJ,ChollangiS,Müller-SpthT,-[J].[11]BuchacherA,,2019,116(9):2275--aspectsofyieldandvirussafety[J].[6]DavidL,BayerMP,LobedannM,,2006,1(2):148-163. pHviralinactivationinsideacoiledflowinverter[J].Biotechnology[12]LebingW,RemingtonKM,SchreinerC