文档介绍：该【贻贝足粘蛋白研究进展样本 】是由【知识徜徉土豆】上传分享，文档一共【12】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【贻贝足粘蛋白研究进展样本 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。贻贝足粘蛋白研究进展
吕玉伟 王睿劼 王英娟＊
（西北大学生命科学学院;陕西省生物技术重点实验室，西安 710069）
摘要 贻贝足粘蛋白是由贻贝类腹足附近足腺合成并分泌到足丝一类特殊粘性蛋白质,可以在水下迅速固化形成具备粘附能力附着基，具备生物降解特性、生物相容性好，无毒、无害、无免疫原性，具备合成胶所不具备特点，始终是粘合剂领域研究热点。当前对贻贝足粘蛋白研究有诸多，通过对既有文献检索，概述了贻贝足粘蛋白质氨基酸构成、构造、基因表达、获取办法、粘附机理及应用等方面研究进展，为贻贝足粘蛋白进一步研究提供参照资料。
核心词 足粘蛋白；粘附机理；Mefp基因；多巴；获取办法
中图分类号
Research progress of Mytilus Edulis Foot Protein
LV Yuwei ,WANG Ruijie ,WANG Yingjuan＊
（College of Life Sciences,Northwest University，Xi’an 710069,China）
Abstract：Mytilus edulis foot protein which is synthesised by Mussels foot gland can rapidly be solidified under water to attache with adhesive ability and it has the nature of biodegradation，biocompatibility，nontoxic ，harmless and no immunogenicity. In addition ,the nature do not have in synthetic rubber. Because its excellent adhesive bonding characteristics ,Mytilus edulis foot protein has been a hot research field. The retrieval of the existing literature on the types of mussel adhesive protein，amino acid composition and structure，genetic expression，adhesion mechanism and genetic engineering research provide scientific information for further study on mussel adhesive protein.
Key words： Mefp ；Adhesion Mechanism ；Mefp gene；DOPA ；Gain
贻贝是双壳类软体动物，俗称海虹和青口，可在水环境中牢固地黏附于各种不同材料表面，其足丝中起黏附作用物质已被证明是各种贻贝足粘蛋白。贻贝足粘蛋白（Mytilus edulis foot protein，Mefp）是由贻贝类腹足附近足腺合成并泌到足丝一类特殊粘性蛋白质，是足丝重要成分，又称多酚蛋白质或贻贝粘附蛋白质
[1-4]。Mefp粘合强度高，能在水下迅速凝固成有黏附能力附着基，呈生物惰性并具备生物降解特性，生物相容性好，对人体无毒、无害、无免疫原性，具备合成胶水所不具备特殊优势，可作为生物粘合剂广泛用于软组织黏接、人造骨骼断骨接合、口腔修复以及眼科手术等，有也许成为此后医用粘合剂研究主流。本文就当前国内外Mefp开发研究及临床应用概况作简要简介。
1 Mefp氨基酸构成及构造
随着Mefp氨基酸构成序列及构造研究，已经懂得Mefp分子量约为l30KD，为碱性多酚蛋白质，富含Pro/hyPro、Ser、Thr、Lys、Tyr、Ala以及多巴（3,4-二羟基苯丙氨酸，DOPA），羟基化和氟基化后脯氨酸残基有助于蛋白对的折叠并且赋予粘蛋白更好黏附性能[5]。
Mefp一级构造由75-80个多肽片段重复构成，多肽片段类型有A、B、B'、C、D、E 6种。其中，E型最为常用是十肽片段（-Ala-Lys-Pro-Ser- Tyr-Hyp-Hyp-Thr-hyPhe-Lys-）；B、C、D型与E型类似，均为十肽片段，差别仅在个别氨基酸残基，B型第3和第5位分别为Hyp和hyPhe，C型第5位则是hyPhe，D型第3位为Hyp；A型、B'型不同于E型，为六肽片段，其中A型肽段为-Ala-Lys-Pro-Thr-hyPhe-Lys-，B'型肽段为-Ala-Lys-Pro-Thr-Tyr-Lys-，两者仅是第5位氨基酸残基不同。
研究发现Mefp糖基化和羟基化限度均非常高，肽链之间交联紧密形成二级构造，其中富含hyPhe，构造异常复杂[6]。
2 Mefp家族及重要家族表达
当前多以紫贻贝为材料开展Mefp研究。紫贻贝中至少有8种足丝蛋白，分别为Mefp1~
Mefp6、preCoID和preCoING，其中胶原蛋白preCoID和preCoING重要构成贻贝足丝蛋白核心骨架并延伸至足丝盘[7]；Mefp-1分布于整个足丝表面而构成足丝保护外套，以防止海水溶解及微生物降解；Mefp2~Mefp6重要位于贻贝足丝盘，是贻贝足丝与外界固体表面形成黏附重要成分。随着对于Mefp家族基因表达研究升温，Genex公司率先用贻贝酚腺中mRNA建立了蛋白质数据库，并鉴定出贻贝足蛋白质氨基酸残基为十肽和六肽交替排列形式。该公司通过mRNA，创立多酚蛋白质cDNA文库，构建大肠杆菌穿梭质粒,在酵母中进行Mefp基因表达研究，证明重组外源基因Mefp可以在宿主中稳定、良好地表达出Mefp。
Mefp-1由80个E型十肽串联重复构成，分子量约为108KD，是Mefp中最大蛋白，重要分布在足丝和附着基外表面涂层中，DOPA含量约为11％，通过与苯醌发生交联反映和与Fe（III）发生金属络合反映，形成致密和坚韧涂层，保护足丝降解。Mefp-1基因重组后，尝试在大肠杆菌、酵母体系中进行表达，但是由于Mefp-1自身特性，大概80个串联十肽重复序列导致质粒不稳定
，从而影响翻译过程，在二宿主很难获得成功表达。
Mefp-2分子量为45KD，在Mefp中约含40％，含量最高，富含胱氨酸和DOPA（约5%）、具有11个串联表皮生长因子（EGF）重复单元，是附着基重要成分，与粘蛋白之间共价交联关于[8]。运用Mefp-2基因构建转化载体，转化巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris，Gs115），通过筛选阳性转化株后，通过与野生型对比组氨酸检测及分子生物学PCR检测，获得Mefp-2基因重组酵母菌株Gs115/mefp21，重组菌株可以通过甲醇诱导和发酵培养[9]。
Mefp-3分子量为5-7KD，无重复单元，在Mefp中含量至少,但DOPA含量高达28%，重要分布在基底面和外界接触界面处，具有Arg，Arg被修饰成4-羟基-L-精氨酸（R）后能以π-π键、库伦互相作用、H-键在金属表面形成有机金属络合物而粘到物体表面。重组Mefp-3基因A型基因Mefp-3A,，在大肠杆菌中表达出Mefp-3A蛋白质分子量为7KD[2]，近来李楠楠等[10]将Mefp-3基因转入到大肠杆菌，Mefp-3蛋白重要以包涵体形式得到了表达。
Mefp-4分子量约为90KD，有各种高度重复序列，富具有大量His、Lys、Arg及Asp，其中His为22%，但DOPA含量仅为2%。与Mefp-2同样分布在附着基上，Mefp-4也许与足丝纤维中胶原蛋白相连接，同步在足蛋白分子之间交连发挥作用[11]。尚未见到基因工程方面研究资料。
Mefp-5分子量为9KD，有76个氨基酸，每四个氨基酸中就会有超过1个DOPA，总含量为30%。与Mefp-3同样，Mefp-5分布于基底面和外界接触界面处。序列中超过1/3残基经羟基化和磷酸化（Ser）修饰，具备强粘合力。 Hwang等从cDNA中克隆Mefp-5构建了具有His6、IPTG诱导启动子标签大肠杆菌表达载体，借助原核表达系统成功表达得到重组Mefp-5蛋白质[12]。
Mefp-，其中序列中含量最丰富是Try(20%),另一方面是Gly(14%),Cys为（11%），但DOPA含量不到5%。有1/3Cys保存了自由巯基，介导足丝盘和黏附蛋白中DOPA之间形成交联构造，且发现了各种天然变异体[13]，鲜见其基因表达研究资料。
3 Mefp获取办法
天然Mefp制成细胞或者组织培养用粘合剂产品“Cell-Tak”,重要是Mefp-1、Mefp-2和Mefp-3混合物，可以使细胞或者组织粘附在塑料、玻璃、金属和各种生物材料等各种材料表面。现阶段从天然贻贝中提取纯化Mefp是获得该粘合蛋白重要途径，也是最直接办法，但是由于贻贝足丝蛋白分泌量极低，一万个贻贝仅能得到
1mg粘蛋白，因此价格昂贵。
有研究通过体外培养足腺细胞来制备粘蛋白，这样不但可以制备高粘度蛋白，并且也有助于研究分泌调控机制，但是由于无脊椎动物细胞普遍存在培养难、成本高等问题，当前足腺细胞体外培养及建系尚未成功[14]。
研究者尝试运用基因工程办法生产贻贝足粘蛋白，获得了一定进展，但是不能完全解决Mefp来源难题。大肠杆菌中表达出重组蛋白质Mefp-3A，亲和层析纯化纯度达99%，产率为18%，在5%醋酸缓冲液中溶解度好，粘性与已经商业化贻贝粘蛋白质Cell-Tak相称[2]；借助大肠杆菌表达重组蛋白Mefp-3，亲和层析后纯度约98%，但黏附性能仅为天然提取一半[10]，也许是天然粘蛋白在贻贝足腺细胞中被合成时经历了复杂羟基化、磷酸化、糖基化及交联反映，与原核生物修饰不同导致其粘附性差别。原核表达重组蛋白质Mefp-5，含量为40 mg/L，占可溶性总蛋白质10%，亲和层析纯化后纯度可达95%，但由于其粘附于层析柱上，回收率仅为7%，并且重组Mefp-5基因表达后几小时，表达速率下降至几乎停止，之后大肠杆菌细胞恢复生长，同步随着着重组Mefp-5蛋白质轻微降解[12]。
4 Mefp粘附机理
Mefp粘附机理始终是贻贝粘蛋白热点研究领域，当前以为Mefp强粘合力与其氨基酸残基密切有关，其中最核心是酪氨酸经羟基化修饰DOPA残基，DOPA能与蛋白质等极性聚合物间形成很强氢键，并且DOPA苯酚基团有很强金属络合力，可以在材料表面形成不可逆有机金属络合物。Qi Lin等[15]发当前云母Mefp (Mefp-1&3)中具有10-20%DOPA，对其粘附力至关重要，除去粘附界面DOPA残基后，其粘着力明显下降[16-17]；在Mefp-5中DOPA含量约占30%（含量最高），拥有粘附能力达到Ead= ̴ -14mJ/m2，超过了任何一种互相作用粘蛋白[18]。研究以为Mefp-3和Mefp-5在水环境中可以保持较佳粘附力，是由于DOPA中酚羟基以供/受H体与金属表面形成形成氢键，强度远不不大于水与金属表面形成氢键[19]，此外残基中磷酸化SerO-磷酸丝氨酸对钙亲和力很强，与金属表面相接触时，磷酸基团负电荷与金属离子互相作用，可以提高粘附性能[20]。此外Mefp-1及Mefp-1中含DOPA多肽，能与Fe3+在20℃、pH10条件下形成稳定三价铁络合物（稳定常数超过1040），以此增强Mefp粘合力；此外DOPA残基与其她芳香基之间存在
π-π非共价键，也能增长Mefp粘附性[21]。
Mefp增长内聚力最重要、最常用是di-DOPA内部共价交联。研究发现Mefp-2和Mefp-4DOPA易被氧化，形成DOPA醌通过Schiff base(希夫碱)和Mickeal加成反映，与Lys和Cys之间交叉结合可以产生di-DOPA[22]，生长中天然贻贝也可以检测到用同位素13C和2H标记Tyr所产生di-DOPA，di-DOPA产生共价交联增长Mefp内聚力，提高粘附性。NaIO4对Mefp吸附作用也有积极地影响[23]，同步光谱学分析在ZnSe表面上由NaIO4和Cu2+所介导Mefp-1互相交联，NaIO4作用类似于儿茶酚氧化酶，有助于di-DOPA共价交联[24-25]。
5 Mefp应用
Mefp在可以排开粘合面水，呈生物惰性，实现水中迅速固化；形成固化膜透明、透气、强度高、韧性好，可以作为一种湿性粘合剂用于防水、防腐和粘接；Mefp在人体内不易引起机体产生免疫反映，可以生物降解，生物相容性较好，具备光谱胶粘性，可以作为一种抱负医用粘合剂。
细胞培养和组织工程
Mefp生物相容性好，可以作为细胞和组织培养液添加剂，增进细胞贴壁生长；也可用于组织工程中人造器官构建，增进细胞与支持物粘附。当前使用贻贝产品“Cell-Tak”能使细胞或者组织粘附在塑料、玻璃、金属等各种材料表面，可以简化原位杂交、免疫组化和原代细胞培养等各种技术中生物学样本操作。有研究发现Mefp-5可以在玻片上有效固定活非帖壁依赖性细胞昆虫DrosophilaS2和人MOLT-4，固定状态中，非帖壁依赖性细胞可以经历1周正常分裂，无细胞学变异。也有研究在涂有fp-151-RGD表面上，细胞凋亡可以被很明显抑制，分析也许由于RGD引起整联蛋白所介导信号通路激活，增进了细胞增殖、扩散，提高了存活率，该研究使fp-151-RGD解决培养器械在细胞培养中成为也许[26]。
防腐
Mefp作为一种生物防腐剂和粘合剂，用于船舶、潜艇、海水养殖设备防水、防腐和防止海洋生物附着，不会损害人们健康和生态系统。由带正电荷Mefp-1和带负电荷二氧化铈纳米颗粒在碳素钢和二氧化硅表面通过层层沉淀复合形成具备黏着力薄胶片，不但可以抵制解吸附作用
[27-28]并且随着Mefp-1浓度增长其耐磨性和防腐能力也会大大增强[29-30]；此外由于NaIO4可以增强Mefp共价交联，因此通过NaIO4氧化后在碳素钢表面由Mefp形成薄层其保护效率增强多达80%，进一步提高防腐性能[25,31]。
临床应用
Mefp可形成透明透气防水有弹性保护膜，具备和眼角膜近似折射率，不干扰光线到达视网膜，无化学刺激无催泪反映，粘接能力和寿命不受水和盐浓度影响，对眼部组织功能无后期影响，在眼科临床中具备独特优势。
Mefp具备优秀生物相容性，可以与表皮细胞、干细胞、血小板等共存，不导致血管堵塞，也可以保护金属，使金属植入物寿命更长。Mefp在聚乙二醇作用下嫁接到具有EVA（ethylene vinyl acetate）表面上后，提高内皮细胞在涂层上粘着力，增进了内皮细胞膜融合并制止了血栓形成[32]。以PDA(dopamine-co-acrylate)为前导粘附剂具备比正常粘附剂高4倍湿粘着力，在外科手术组织粘附中应用很大[33]。
在金属材料表面（如钛），Mefp和透明质酸发生凝聚作用形成凝聚层，提高了金属表面亲水性和表面能，可以增进成骨细胞增殖[34]，运用基因工程技术得到重组粘合蛋白材料类似并优于天然粘合剂；当用凝聚层去溶解油滴时，可以形成有黏附性能微胶囊颗粒/微球体，有助于生物体内药物运送[20]；在相似条件下与游离药物相比，由PDA（polydopamine）所运送阿霉素胶囊体可以增强根除Hela癌细胞效率，这对用PDA作为药物运送载体提供了一种新平台[35]。
Mefp（DOPA）参加CaCO3矿化作用形成，氧化了DOPA不但可以稳定球霰石形成，并且可以使球霰石微粒很容易转变为碳酸化羟基磷灰石，而碳酸化羟基磷灰石具备很高生物再吸取能力， 与天然骨骼和牙齿相似，对治疗骨缺损和骨退化性疾病有辽阔前景[36]。
此外，Mefp作为生物粘合剂，在肝外胰岛素移植中引起急/慢性炎症反映最小，有助于切口界面恢复[37]；也不会导致闭合后切口或创口硬化，保持皮肤弹性；可以抑制细菌生长，但不会对哺乳动物细胞生存能力产生影响[38]；用于瘢痕痒感治疗，缓和彻底、起效迅速、使用简朴，无明显不良反映[39]；具备重复粘接性，可以在切口或创口闭合过程依照需要中可以进行调节，适合于美容外科切口闭合和外部形态高规定
。
6 展望
贻贝足粘蛋白具备湿性粘结性能，黏附强度高，作为天然蛋白质不会对环境导致污染，特有光谱胶特性、优质生物安全性和相容性不会损害人体健康，在临床应用中逐渐成为宠儿，成为众多科学家关注热点。自上世纪80年代以来，人们已经对Mefp及其基因构造、功能以及有关黏附机制进行摸索，对其应用和开发展开研究，获得了较多研究成果。当前获得贻贝足粘蛋白重要依托天然贻贝提取纯化，随着对贻贝粘附蛋白黏附机理等进行不断进一步研究，有望通过生物技术办法诸如改进细胞培养、基因工程表达方案等，生产出具备黏附强度高、韧性强、耐久性和防水性优质贻贝生物粘合剂，将获取优质粘蛋白粘合剂新材料抱负变为现实，应用前景辽阔，经济和社会效益明显。
参照文献
Hwang DS，Yoo HJ，Cha HJ，et al. Expression of functional recombinant Mussel Adhesive
Protein Mefp-5 in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology，，709(3)：
3352-3359.
Hwang DS，Gim Y，Cha HJ，et al. Expression of Functional Recombinant Mussel Adhesive Protein Type 3A in Escherichia coli. Biotechnology Progress，，21：965-970
Waite ,Tanzer Substance of Mytilus edulis：Novel Adhesive Containing L-Dopa and Hydroxyprolin. Science，1981，212(4498)：1038-1040
Waite JH，Housely TJ，Tanzer ML. Peptide repeats in a mussel glue protein：theme and variations. Biochemistry，1985，24 (19)：5010-5014
Larregola M，Moore S，Budis N,. Congeneric bio-adhesive mussel foot proteins designed by modified prolines revealed a chiral bias in unnatural translation. Biochemical and Biophysical Research Communications， ,421：646-650
Waite . Evidence for a repeating 3,4-dihydroxyphenylalanine-and hydroproline-containing
Decapetide in the adhesive protein of the mussel ,Mytilus edulis L. The journal of biological
Chemistry，1983，258(5)：2911-2915
Waite ，Ersen NH，Jewhurs TS. Mussel adhesion：finding the tricks worth mimicking. Adhesion，，81：297-317
Inoue k，Takeuchi Y，Miki D,et a1．Mussel adhesive plaque protein gene is a novel member of
epidermal growth factor like gene family. The Journal of Biological Chemistry，1995，270：6698-6701
郑昕,，，21(2)：100-102
李楠楠,谭亮,王智平,等. 厚壳贻贝足丝黏附蛋白Mefp-3重组表达及黏附功能分析. 中华人民共和国化学和分子生物学报，，27(9)：851-857
Zhao H，Waite JH. Proteins in load-bearing junctions：the histidine-rich metal-binding protein of mussel byssus. Biochemistry，，45(47)：14 223-14 231
Hwang DS，Gim Y，Kang DG，et al. Recombinant mussel adhesive protein Mgfp-5 as cell adhesion biomaterial. Journal of Biotechnology，，127(4)：727-735
Zhao H，Waite JH．Linking Adhesive and Structural Proteins in the Attachment Plaque of Mytius califormianu. Biol Chem，，281(36)：26 150-26 158
樊廷俊,汪小峰. 贻贝足腺细胞超强度粘液[J].生命化学， ,21(4)：174-175
Lin Q,Gourdon D,Chengjun S,et al. Adhesion mechanisms of the mussel foot proteins mfp-1 and mfp-3. PNAS，，104(10)：3782-3786
Lee H，Schever N，Norbert F,et al. Single-molecule mechanics of mussel adhesion . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，，103(35)：12999-13003
Monahan J，Wilker J，et al. Specificity of metal ion cross-linking in marine mussel adhesives. Chemical communications， ,14：1672-1673
Danner EW，Kan YJ，Hammer MU,et of Mussel Foot Protein Mefp-5 to Mica:An Underwater ，，51(33)：6511-6518
Waite engineering of bioadhesion in marine mussels. Annals of the New York Academy of Science，1999，875：301-309
Seonghye L，Choi YS，Kang DG，et al. The adhesive properties of coacervated recombinant hybrid mussel adhesive proteins. Biomaterials，，31(13)：3715-3722
Lu QY，Hwang DS，Liu Y，Zeng HB. Molecular interactions of mussel protective coating protein，mefp-1，from Mytilus californianus. Biomaterials，，33(6)：1903-1911
Butzio LA，Waite JH. Cross-linking in Adhesive Quinoproteins：studies with Model Decapetides. Biochemistry,,39(36):11147-11153
Krivosheeva O，Dedinaite A，Claesson of Mefp-1：Influence of pH on adsorption kinetics and adsorbed amount. Journal of colloid and interface science，，379：107-113
Fant C，Hedlund J，Hook F,et of Adsorption and Cross-Linking of a Mussel Adhesive Protein Using Attenuated Total Internal Reflection Fourier Transform Infrared Spectroscopy (A-TR-FTIR) . The Journal of Adhension，，86(1)：25-38
Zhang F,Pan JS,Claesson PM ,et ，atomic force microscopy and infrared reflection absorption spectroscopy studies of pre-formed mussel adhesive protein films on carbon steel for corrosion protection. Thin solid films，，520(24)：7136-7143
Kim BJ，Choi YS，Choi BH，et al. Mussel adhesive protein fused with cell adhesion recognitionmot ftriggers integrin-mediated adhesion and signaling for enhanced cellspreading ,proliferation，and survival. Wiley InterScienc，,3：886-892
Sababi M，Zhang F，Krivosheeva O，et al. Thin Composite Films of Mussel Adhensive Protein and Ceria Nanoparticles on Carbon Steel for Corrosion Protection. Journal of the Electrochemical Society，，159(8)：C364-C371
Krivosheeva O,Dedinaite A，Claesson PM. Salt- and pH-induced desorption：Comparison between non-aggregated