文档介绍：第三章分子克隆载体
§1 概述
§2 克隆载体
§3 大肠杆菌表达载体
§4 目的基因与载体的连接
第一节概述
载体(vector)是指将外源DNA或基因携带进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。
按工作方式:质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、人工染色体载体等。
按功能:克隆载体和表达载体,表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。
按受体细胞:原核细胞载体和真核细胞载体。
载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞。
为外源基因提供复制能力或整合能力。
为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
第二节克隆载体
克隆载体(cloning vector):是指用于扩增或保存外源DN***段而设计的载体。
克隆载体的结构特征
多克隆位点(multiple cloning site)
ori
复制起始点
遗传标记
pUC
MCS
Ampr
克隆载体具备的条件
①载体都能携带外源DN***段(基因)进入受体细胞,或停留在细胞质中自我复制,或整合到染色体DNA上,随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点,即多克隆位点。
③载体都具有合适的遗传标记基因。
④载体都必须是安全的,不应含有对受体细胞有害的基因,并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞,尤其是人的细胞。
⑤载体本身的分子量都比较小,可容纳较大的外源基因片段。
⑥载体在细胞内的拷贝数要高,方便外源基因在细胞内大量扩增。
⑦载体在细胞内稳定性要高,保证重组体稳定传代而不易丢失。
⑧载体的特征都是充分掌握的,包括它的全部核苷酸序列。
一、质粒载体
质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体,主要用于原核生物和植物的基因转移以及建立基因文库和cDNA文库。
(plasmid )的概念:
独立于染色体外能够进行自我复制的双链DNA分子。
天然DNA质粒具有3种构型:cDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。
Plasmid chromosome
ccc

(1)质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态,但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体地复制而复制。
(2)质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后,可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒,并在真核细胞中表达,因此这类载体在基因工程中应用广泛。
(3)质粒的拷贝数:是指每个宿主细胞内质粒的数量。根据每个宿主细胞中质粒拷贝数的多少,把质粒分为严紧型复制质粒(拷贝数少,为1-5个)与松弛型复制质粒(拷贝数多,可达10-200个拷贝)。因此,作为载体的质粒应该是松弛型的。
(4)质粒的不相容性(patibility,又称质粒的不亲和性):两种亲缘关系密切的不同质粒,不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存的现象。