文档介绍：分子克隆及细胞培养基本实验方法1•—20%甘油菌2体积菌液与1体积70%的甘油混合后,储存于・20°C或・70°C备用。(甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可)1・2甘油菌复苏、培养方法一、挑取甘油菌一环,接种在含100ug/mlAmp的LB固体培养基上(活化菌种),37°C培养过夜(约16小吋);挑取一个菌落转接在含100ug/mlAmp的LB液体培养基屮,37°C振荡过夜(约12〜16小时)。方法二、直接吸取10~20ul甘油菌,接种在含100ug/mlAmp的LB液体培养基中,37°C振荡过夜(约12〜16小时)。1・3小规模制备质粒DNA(QIAminiprepkit)适于从1〜5ml菌液屮制备20ug高拷贝质粒⑴收集菌液,离心1OOOrpm,1分,弃上清⑵以250ulPI重悬细菌(P1中已加RNase)⑶加入250ulP2,颠倒4〜6次轻混,约2〜3分(轻混以免剪切基因组DNA,并免长时间消化)⑷加入350ulN3,迅速颠倒4〜6次轻混;离心10分,13OOOrpm⑸上清入QIAprep柱,离心30〜60秒,滤液弃之⑹,离心30~60秒(7),离心30〜60秒,弃滤液,再离心1分⑻换新管,加入5()ulEB,静置1分(EB37°C预热),离心1分。⑴体系构成(反应体系尽口」能小!)pGEM3ZF-huCTLA4-Ig(ul)pAdTrack-CMV(ul)335Total: 17lOXNEbuff2 3©10XBSA 3④底物DNA 5⑤内切酶HindlllXbaI⑵37°C水浴1〜2小时,必要吋延长酶切吋间至12小吋⑶酶切2小时后,取5-10ul电泳观察酶解是否完全⑷65°C灭活内切酶((QIAquickGelextractionProtocol)⑴胶,尽可能去除多余的胶,称重;⑵加入适量buffQG(300ulQG/100mg胶);>2%的胶,应加大QG用量(600ulQG/100mg);⑶水浴50°C,lOmin,每2-3min混匀一次,使胶完全溶解!必要时延长水浴时间,胶完全溶解后混合物颜色应为黃色,与buffQG和似;当DN***段在<500bp或>4kb时,应加入异戊醇100ul/100mg胶,以提高产物量。此步不离心。DN***段在500bp〜4kb吋,加入异戊醇并不能提高产量;结合:将混合物转入QIAquick柱,离心13000rpm,lmin;(柱容量800ul/次);⑹洗:,离心13000rpm,lmin;(DNA用于盐嫩感操作时,如平端连接、直接测序,加入PE后静置2-5min);弃离心液,再离心13000rpm,lmin,以去除剩余的乙醇;⑺,加入30〜50ulbuffEB或出。(滴于QIAquick膜上!),静置lmin,离心15000rpm,lmin;(8)-20°C保存备用。⑴体系构成(反应体系20ul,载体:H的片段二1:3-5,摩尔数比)反应组份数量(ul)(ul)冃的片段(ul)8218④T4DNA连接酶1Total:20ul⑵16°C水浴12・16小吋(过夜)⑶直接用于转化或・20°⑴菌种10-20ulA5mlLB液体培养基(不力口Amp),37°C振摇4-6hr,至中对数期;菌液冰浴lOmin,分装2管,离心(4°C,4000-6OOOrpm)收菌;弃上清,(冰预冷)中,冰浴lOmin,离心(4°C,4000-6000rpm);(冰预冷)中,冰浴,12-24hr可用。菌体沉淀时,重悬操作要轻。,加入2-10ul连接产物,轻轻旋转混合,冰浴30-60min;⑵42°C热休克90sec,勿摇动试管,再冰浴2min;⑶加入液体LB培养基(无抗生素)800ul,37°C温和振摇45-60min;⑷离心4000-6000rpm,2min,弃去900ul±清;剩余物重悬细菌,铺Amp板,平放20min,倒置培养10-14hro1・9鉴定重组子常规PCR法鉴定重组子(25ul反应体系,lul菌液)或抽提质粒DNA酶切鉴定。⑴PCR反应体系:试剂数量终浓度①②③MgC12(25mM)④dNTPmix()1ul50uM⑤上游引物(25pmol/ul)(25pmol/ul)