文档介绍：摘要— 1 —超声微泡造影剂增强治疗基因心肌转染率的实验研究博士研究生:姜新魁导师:穆玉明教授摘要目的: 本研究旨在探讨应用超声微泡造影剂作为基因治疗的载体,通过定位释放技术将 SERCA2a 基因通过微泡造影剂的示踪作用转移至受损心肌微循环处,为靶向基因治疗探索出一种低创伤、高效以及安全的的基因输送方法。方法: 将同种属同窝别同年龄雄性 SD 大鼠 35 只,体重为 250 ~ 300 克,随机分为分为 3 组:即假手术组、心肌梗死组和基因治疗组。假手术组仅开胸不结扎冠状动脉;其余两组结扎冠脉左前降支近端,造成前壁心梗。将心功能符合要求、且心梗后仍存活的大鼠及假手术大鼠共计 29 只动物纳入本研究。首先对心肌梗死组及基因治疗组大鼠于心梗术前、术后 1 日、 4 周和 8 周进行心脏超声检查,并按照不同观察时间点分为术前对照、心梗 1 日、 4 周和 8周共四组。使用 GE Vivid 7 Dimension 超声诊断仪经左胸壁进行心脏超声心动图检查。分别测量超声短轴乳头肌水平径向应变率( radial strain rate , SRrad )和圆周应变率( circumferential strain rate , SRcir )的收缩期峰值应变率 SRrad-S 和 SRcir-S ,舒张早期峰值应变率( SRrad-E )和 SRcir-E ,舒张晚期峰值应变率 SRrad-A 和 SRcir-A 。测量左室二维超声指标。在心梗术后 4 周给予不同干预,即假手术组及心肌梗死组经尾静脉注射空载超声造影剂;基因治疗组经尾静脉注射 rAAV2-SERCA2a 基因( 1. 5 × 10 11vg/ml )和微泡造影剂混合液,输入液体量均为 。使用 i13L 线阵探头经左胸壁进行心脏超声心动图检查。仪器设置为低机械指数( MI ﹦ )。当心肌组织内见微泡造影剂充盈时立即换成 M3S 探头,探头频率为 ~ MHz ,启用二次谐波功能,发射频率为 ,接收频率为 MHz 并进入反向编码实时心肌造影模式,使机械指数调至 ,利用 FLASH (fast low-angle shot , FLASH )功能破坏心腔及心肌组织中的造影剂微泡,并进行心电触发,每三到六个心动周期触发一次,以达到定点爆破造影剂微泡的目的。每触发一次间隔 2 ~ 5S ,以利于下一心动周期有足够的超声造影剂进入心肌组织内。于超声爆破干预 4 周之后,检测左室心功能,处死大鼠,分别取出大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及大脑组织于冰冻管内,以 RT-PCR 和 West en 印迹法检测各组大鼠各主要脏器内 SERCA2a 基因 mRNA 及蛋白表达量。以双夹心 ELISA 法检测各组大新疆医科大学医学博士学位论文— 2 —鼠血清中 TNF- α、Ang II 、 ANP 、ET-1 以及 IL-6 等神经内分泌因子水平。并检测了反映大鼠肝肾功能的谷丙转氨酶( ALT/GPT )、谷草转氨酶( AST/GOT )、血尿素氮( BUN )以及血肌酐( Cr)血清浓度。结果: 心梗 1 日组 SRrad-S 、 SRrad-E 、 SRci-S 及 SRci-E 在前壁和侧壁较心梗手术前相应节段降低。心梗 4 周组和心梗 8 周组 SRrad 、 SRcir 在各节段较心梗手术前相应节段均降低。心梗 8 周组左室心肌各节段 SRrad 、 SRcir 与心梗 4 周时相比几无差别。在基因转导 4周之后,治疗组大鼠左室舒张末期内径 LVDd 较安慰剂组大鼠组显著减少,差异有统计学意义( P < ) ; 治疗组大鼠 LVFS 、 EF 则较安慰剂组大鼠组恢复,而与假手术组无差别。应用斑点追踪成像技术对各组大鼠心肌功能评价,证实在 SERCA2a 基因转导 4 周之后,基因治疗组大鼠乳头肌水平各节段径向、圆周收缩期舒张早期应变率左均高于心肌梗死组,差异有统计学意义( P < ) ;而与假手术组无差别。基因治疗组径向、圆周舒张晚期多数节段应变率较心肌梗死组有不同程度改善。此外,基因治疗组二尖瓣、心尖水平短轴最大收缩期旋转角度及左室扭转角度均高于心肌梗死组( P < );而与假手术组无差别。此外, RT-PCR 以及 West en 印迹法表明,在接受超声干预 4 周之后,基因治疗组大鼠心肌组织 SERCA2a 蛋白表达较心肌梗死组明显增加( P < ) ,而与假手术组无差别。对基因治疗组和心梗对照组大鼠其他组织间 SERCA2a 蛋白的表达进行比较,除基因治疗组大鼠肺脏组织 SERCA2a 蛋白的表达高于心肌梗死组外( P < ) ,其余各组织两组间 SE