文档介绍：ICS
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SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T XXXXX—XXXX
油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法
Detection and Identification of Leptosphaeria maculans (Desm)
Ces. & de Not. of colza
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XXXX - XX - XX发布
XXXX - XX - XX实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布
前言
-2009给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准主要起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局，中国检验检疫科学研究院，上海出入境检验检疫局，江苏出入境检验检疫局，华中农业大学等
本标准主要起草人：赵晖，王振华，易建平，吴翠萍，周国梁，曾宪东，李彬，吴品珊，李国庆。
本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。
油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法
范围
本标准规定了油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定方法。
本标准适用于油菜繁殖用种子和油用种子、种苗、植株等油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 原理
分类地位
油菜茎基溃疡病菌 (Leptosphaeria maculans (Desm) Ces. & de Not.)，属真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota)，座囊菌纲（Dothideomycetes），格孢腔菌目（Pleosporales），格孢腔菌科（Pleosporaceae），小球腔菌属（Leptosphaeria），无性态为Phoma lingam。
该病菌在世界上的分布参见附录Ａ
该病菌的寄主广泛，主要有芸苔属植物,如油菜、甘蓝、花椰菜等十字花科作物。可造成油菜茎基及根系腐朽，易于折断而死亡。
鉴定原理
根据油菜茎基溃疡病菌在培养基上生长的菌落、菌丝、分生孢子和分生孢子器形态，以及其在寄主上的为害症状、形态学特征和PCR特异扩增片段作为鉴定依据。
4 仪器设备和用具
仪器设备
生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、高压灭菌器、PCR仪、凝胶成像系统、电泳系统、实时荧光PCR仪、培养箱、低温冰箱。
用具
可调微量加样器（2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL）及其枪头、网筛（ mm）、研钵、吸水纸、培养皿、试管、、研钵、离心管（ mL、 mL）、PCR管（ μL）、量筒、烧杯等。
5 试剂和培养基
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T 6682。
1％次***酸钠。
DNA提取试剂：DNA提取试剂盒，异丙醇，无水乙醇。
PCR试剂：PCR Buffer (含Tris-HCl，MgCl2)，Taq酶，dNTP。
凝胶电泳试剂：琼脂粉，TAE，Loading Buffer，EB。
麦芽琼脂培养基：6 g麦芽提取物，3 g琼脂，200 mL蒸馏水，，121℃，15 min灭菌。
对照菌株：油菜茎基溃疡病菌（ Leptosphaeria maculans (Desm) Ces. & de Not.）标准菌株、油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）。
6 检疫鉴定方法
取样
种子：待检样品混匀，取1 kg用作试验样品， mm的网筛过筛试验样品，筛上物多为豆荚等植株残体，筛下物多为油菜籽碎片或小形种子。取筛上物、筛下物和种子各1 g~2 g用于PCR初筛。
植株：主要检查茎根部和叶部。选取叶片上出现圆形或不规则形，稍凹陷，中部灰白色病斑，
部分斑内散生许多小黑点症状的病变部位。植茎则选取不规则形淡褐色斑；或灰白色病斑，稍凹陷，上生黑色小点；或茎基及根系溃疡、枯萎症状的病变部位（参见附录B）。
PCR初筛
样品DNA提取
取筛上物、筛下物和种子，或植株可疑病变组织各1 g ~2 g，液氮研磨