文档介绍：SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T xxxx—2010
蓝莓矮化植原体检疫鉴定方法
Mathod for indentification of bluberry stunt phytoplasma
（送审稿）
XXX X —X X —X X发布
XXX X —X X —X X实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准负责起草单位：辽宁出入境检验检疫局。
本标准起草人：王有福。
本标准等同采用EPPO植物检疫标准(PM 7/62 (1)) 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。
蓝莓矮化植原体检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定方法。
本标准适用于进出境蓝莓树苗木及接穗中蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定。
2术语
本标准涉及以下术语：
PCR PoIymerase Cha i n React i on
以耐热DNA聚合酶和一对引物（与待测目标核酸分子序列同源的DN***段）通过高温（DNA分子变 性）和低温（引物和目标核酸分子复性并被耐热DNA聚合酶延伸）交替循环扩增待测目标核酸分子的 方法。
3原理
蓝莓矮化植原体（blubeiTy stunt phytoplasma）,硬壁菌门，柔膜菌纲，无胆笛支原体目，无胆笛支 原体科，植原体属，16SrI植原体组。该病害主要寄主为蓝莓，依靠带病苗木进行远距离传播。其生物 学特性和基因序列等分子生物学信息是该检疫鉴定方法的依据。
4器材和试剂
PCR仪、灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、移液 器、电泳仪、凝胶成像系统。
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。DAPL PCR缓冲液、MgCL、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物 等。
5病菌的鉴定
5. 1症状观察
仔细观察蓝莓种苗、叶片等，症状描述见附录A. 1。
5. 2 DAPI 染色
选取幼嫩组织（新叶叶梗，枝梢，茎杆及根部韧皮部组织），切片，用1 kig/mL DAPI溶液（4',6- 二月米基-2-苯基口引嗥）染色，在460 nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧 光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。 5. 3电子显微观察
将采集的样品制备超薄切片，通过电子显微镜观察植物韧皮部是否存在植原体粒体。方法见附录B。 5. 4巢氏PCR检测及测序
采用植原体巢氏PCR通用引物进行检测并测序（见附录C）
6结果判定
，可初步判定为蓝莓矮 化植原体，。
，若通过电子显微镜观察，发现桃树韧皮部筛管中含有直径为500-1000的圆形、椭圆 形、不规则形状等的菌原体，则可初步判定为蓝莓矮化植原体，。
SN/T xxxx—2008
，若PCR产物凝胶电泳检测为阳性，可初步判定为蓝莓矮化植原体，经序列测定并比 对后，。
7样品保存与复核
7. 1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出蓝莓矮化植原体的样品应保存于-20 °C冰箱中，以备 复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验 人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。
由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和 真实性，必要时进行复核实验。
附录A
(资料性附录)
A. 1 DNA提取方法
称取100mg植物材料，剪成小块放入研钵中，加入液氮，待样品冷冻完全后快速、用力研磨至 粉状。将研钵移至65°C水浴，当粉末刚开始融化时，向研钵中加入700|il的Solution Al,用力研磨30秒。收集650卩1研磨好的组织匀浆移至Collection Tube中。如匀浆体积不足650pil,补 充Solution A至650p,lo 65°C保温 15mino
加入400pl的Solution B,振荡混合。
加入lml的4°C预冷的Solution C,充分混匀后，12, OOOrpm离心2mino
弃去上层有机相，再加入lml的4°C