文档介绍：实验紫外分光光度法测定蛋白质含量
分光光度法原理
Lambert-Beer定律（光吸收定律）
溶液质量浓度（C）越大, 液层厚度（L）越厚, 则溶液对光线吸收得越多。
当入射波长、液层厚度和溶液温度一定时（即K吸光系数为定值）, 溶液对光线吸收与溶液中吸光物质浓度成正比。
所以可经过测量溶液吸光度来求得被测组分含量。
入射光
I0
出射光
It
反射光
Ir
Ia
吸收光
It／I0 ＝ T
T （ transmittance ）称为透光度 , 表示透过光强度是入射光强度百分比。
A∝C 光密度与浓度成正比
T与C成反比，浓度愈大，T愈小
A=
- lg
=
KCL
T
A （Absorbance）称为吸光度，指溶液对光线的吸收程度又称为光密度（Optical density， OD ）。
分光光度法应用
用标准管法计算待测液浓度
在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液吸光度（AS）, 及未知浓度（CU）溶液吸光度（AU）, 依据定律得: AU=KUCULU ;
AS=KSCSLS
因为KU=KS, LU=LS
所以AS与AU之比值也等于两浓度之比值
即 AU/AS=CU/CS , CU=
AU
AS
×CS
分光光度法应用
用标准曲线法求出待测溶液浓度
先配制一系列已知浓度测定物溶液, 分别测得各管吸光度。以各管吸光度为纵坐标, 测定物含量为横坐标; 在方格坐标纸上作图即得标准曲线图。
吸光度A
蛋白质浓度C（μg/ml）
.
.
.
.
40
80
120
160
分光光度法
分光光度法是利用物质所特有吸收光谱来判别物质或测定其含量一项技术。
特点: 分光光度法灵敏度较高、正确度高、操作简便、快速。
分光光度法所使用光谱范围关键是波谱图中200～1000nm为一段波长光谱。
紫外光区200～400nm
可见光区400～760nm
红外光区760～1000nm
分光光度计基础结构
光源
单色
光器
吸收池
测光
机构
钨丝灯
氢灯
氘灯
棱镜
衍射光栅
玻璃比色杯
石英比色杯
硒光电池
光电管
光电倍增管
将光能转变为电能, 光电流强弱与溶液吸光量强弱相关。