文档介绍：或许很多人会说分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，我认为连接的问题多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。以下我详细说明。
1，PCR引物的设计。
通俗地说，很多人用了很多软件设计来设计去，又是考虑发夹结构，又是考虑二聚体，又是考虑Tm值，折腾来折腾去，但其实没那么复杂。首先保证你要的基因是正确的，这个可以从NCBI中找到，大部分是没问题的，然后再找到起始密码子，从那开始大概上游取20-27bp，加上酶切位点，加上保护碱基（一般3个）就是上游引物，取后20-27bp碱基，反向互补，加上酶切位点和保护碱基组成下游引物。这样引物设计就完成了，可以放到软件里看看GC含量，Tm值，发夹结构，二聚体等，适当调整碱基个数和保护碱基的个数。需要额外注意的是移码问题。
需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的***化问题。做普通的克隆会涉及到***化形式有两种：dam***化和dcm***化。常用的大肠杆菌都有这两种***化酶。dam***化酶识别GATC位点并***化；dcm***化酶识别CCWGG位点（W是A或T）并***化。如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。容易受***化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就***化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你，dam***化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam***化，等等有好多。这些容易***化的切点设计引物时一定要注意，避免引入***化位点。如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把***化的质粒转化到***化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有***化，可以切了。***化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。
2，PCR产物。
两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。我个人强烈建议第二种，连T载体。因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。连T载体的优点：①进载体后，大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的，不用总PCR往出调了，再说PCR那东西还不太稳定，一把多一把少的。②酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。连T载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突，这就要小心鉴别；而且连T载体最好测序看一下PCR的产物对不对、切点对不对。总体来讲连T载体是很有优势的。
3，提质粒
有时手工小提或粗提的质粒酶切效果不好，这可能是提取的不够纯或者内切酶品质不好。所以若酶切效果不佳建议用柱子精提或大提。4，酶切
用于连接的酶切很关键。需注意如下几点：
①如果是双酶切A和B，预实验中必须做A和B各自的单酶切和A+B的双酶切,好确认这几种酶都好用，质粒上的切点都好用。如果切不开就要考虑是不是酶的问题，b