文档介绍：.
分子克隆技术实验讲义
上的 DNA 片段、自身环化的
DNA
分子和连接上污染
DNA 片段的重组 DNA
分子，未连接上的载体和
DNA 片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降
精品
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解掉；对克隆工作带来影响的是后两种分子，因为它们都为环状，在细菌细胞中都能复制，因而都能产
生克隆， 但是每个细胞中只能导入一个质粒 DNA 分子，每个单克隆都是由一个细胞形成的， 因此在每个
克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒。所以只要对不同的克隆进行筛选，就可以鉴定所需的重组 DNA
分子。
精品
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所谓的重组子（ recombinant）也叫做转化子（ transformant）是指吸收了重组 DNA 分子的转化细胞。
将重组子从其它细胞群中（如上面提到的对克隆影响较大的自身环化的 DNA 分子和连接上污染 DNA 片
段）分离出来，并鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因，这过程称为筛选（ screening）。根据载体体
系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同，初步把筛选方法分为直接筛选和间接筛
选，直接筛选法又可进一步分为 DNA 鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法；间接筛选也可
以进一步分为免疫学方法、 mRNA 翻译检测法；本试验采用平板筛选法中的蓝白筛选法。
相关知识点：
①转化（ transformation ） 质粒（ plasmid）
②转染 (transinjection) 噬菌体（ phage）
③显影注射
（1）导入的方法 ④电转化
⑤基因枪 geneblaster
⑥脂质体介导法
⑦其它方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法
2）重组子： 转化子
3）重组反应体系中的成分：①②③④⑤⑥
4）筛选的方法
DNA 鉴定筛选法：定位、测序
①直接筛选法 选择性载体筛选法：λ 包ph裹、抗药性 α-互补
分子杂交筛选法： ISH 、 Southern Blot
免疫化学
免疫学方法
②间接筛选法 酶免疫检测
mRNA 翻译检测法
（五）质粒 DNA 的提取（碱裂解法）
原核生物没有真正的细胞核， DNA 一般位于一个类似“核”的结构——称为类核体上（因为不是一
个完整的细胞核） 。 的遗传物质主要是染色体 DNA ， 的染色体为双股环状 DNA ，含有 1
精品
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400 个以上的基因，另外还有一些质粒 DNA 。
1、质粒的概念
质粒是细菌（如 ）染色体外的小型环状双链 DNA 分子。一般说来，质粒不是细菌生长繁殖所
必须的结构，就细胞生存而言，质粒是可有可无的。质粒分子本身含有复制功能的遗传结构，故能在细
菌内独立地进行复制，并在细胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。
2、研究质粒的意义
（ 1）质粒作为一种裸露的，比病毒更简单、更有自主复制能力的 DNA 分子，正好处于生命与非生
命的分水岭上。由于质粒能够复制、能够传递、能够表达其遗传信息，说明质粒是独立的有机体，是亚
细胞生命体系的成员，是比病毒更简单的原始生命形态，所以质粒是研究生命起源的一块重要的基石。
2）要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫载体。由于质粒具有遗传传递和遗传交换的能力，因此，质粒作为基因工程的重要运载工具，在现代分子生物学占有重要地位。
3、质粒的分类
不同的质粒在宿主细胞中的拷数也不同，根据质粒在细胞中拷贝数的多少， Rownd（ 1969）把质粒分
为严密型质粒和松弛型质粒。
（ 1）严密型质粒（ stringe