文档介绍：HPLC法分析叶用芥菜种子中莱菔硫烷含量
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摘要:为了筛选富含莱菔硫烷的叶用芥菜材料,以20份叶用芥菜种子为试材,采用高效液相色谱法(HPLC)测定芥菜种方法主要为高效液相色谱法(HPLC)[12]。李占省等[22]对29份青花菜和48份甘蓝的不同器官中莱菔硫烷含量进行了HPLC分析,发现花球、叶片和幼茎中的莱菔硫烷含量存在明显差异,花球中的含量最高。李占省等[12]对23份芥蓝纯合自交系和21份杂交F1材料花薹中的莱菔硫烷含量进行了测定,不同材料中莱菔硫烷含量差异较大。王丽红等[23]对十字花科植物光果葶苈中的莱菔硫烷含量进行了测定,并优化了HPLC法检测光果葶苈中莱菔硫烷含量的方法。对芥菜种子中莱菔硫烷含量的研究未见报道,本试验以20份叶用芥菜高代纯合自交系种子为材料,利用HPLC法测定其莱菔硫烷含量,旨在筛选出莱菔硫烷含量较高的叶用芥菜材料,为选育新品种及材料创新提供依据,为进一步满足人们的多样化需求奠定基础。
1 材料与方法
主要仪器及试剂
安捷伦高效液相色谱仪系统(美国安捷伦公司):Agilent 1100 四元泵;Agilent 柱温箱;Agilent 色谱数据工作站;Agilent 二极管阵列紫外检测器。超声波清洗机 (昆山市超声仪器有限公司);旋转蒸发仪(德国IKA)。
莱菔硫烷对照品(美国LKTTM,纯度≥98%),乙***(色谱级),乙酸乙酯(分析纯),磷酸(优级纯), μm孔径的微孔滤膜 (上海兴亚公司)。 材料
试验所用材料由云南省农业科学院园艺作物研究所十字花科课题组提供,具体信息见表1。
方法
试样制备 g种子研磨成粉末状,置于通风橱内干燥(干燥后的样品避免受潮,用自封袋密封保存且放置于干燥低温环境中), mL pH ( mol/L,磷酸氢二钾和磷酸二氢钾),磁力搅拌器下反应 h(室温)后加入6 mL的乙酸乙酯(AR)混匀30 min后,4 000 r/min下离心10 min,收集上清液;再重复提取2次,收集3次的萃取液在旋转蒸发仪上蒸干,旋蒸温度为35 ℃,最后用6 mL乙***定容, μm滤膜后-20 ℃低温保存待测。
色谱条件 采用安捷伦系列高效液相色谱仪,反相C18柱(250 mm× mm,5 μm);流速1 mL/min; μL;梯度洗脱法测定,流动相A泵为纯水液,B泵为100%的乙***,梯度程序见表2。
线性方程、精密度、回收率
1)线性方程。以莱菔硫烷标准液(575 [μ]g/mL)、、、、、 [μ]g/mL称释液分别进样,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,计算标准曲线和线性方程。
2)精密度测定。 μg/mL的莱菔硫烷溶液,反复进样测定6次(n=6),根据测得的峰面积计算精密度。
3)回收率测定。准确称取已知含量的芥菜种子样品,分别加入一定量的标准品溶液,按照前述的试样制备方法测定前后浓度,测定回收率。
数据处理
试验数据采用Excel软件和SPSS软件对检测结果进行方差分析和显著性检验(one-way ANOVA),数据用平均值(Mean)±标准差(SD)表示。
2 结果与分析
线性关系
、、、、、 μg/mL标准品稀释溶液,以20 μL进样,以峰面积(Y)对浓度(X)进行回归分析,得线性回归方程Y= 8X+ 9,R2= 6,~ μg/mL与峰面积线性关系良好。
精密度与回收率
精密度 芥菜种子样品和莱菔硫烷标准品的目标峰保留时间基本一致,目标峰不受杂质干扰(图1和图2),表明该法能够准确检测出莱菔硫烷成分。吸取标准品溶液,反复进样测定6次,根据测得的标准品各成分峰面积,%,表明精密度良好(表3)。
回收率 在“”色谱条件下测定莱菔硫烷的含量,样品的加樣回收率较高,%(表4),%。
芥菜种子中莱菔硫烷含量
从表5可以看出,20份芥菜材料种子中均检测到莱菔硫烷成分,供试材料间莱菔硫烷含量差异显著,具有统计学意义,且变化幅度较大。~226