文档介绍：2分子克隆
The Double Helix (1953)
The foundation of molecular biology
Francis H. Crick
James D. Watson
② 同理，要求6bp的酶，则平均46遇到一个靶序列，即1/4096。
GGATCC
CCTAGG
BamH Ⅰ
特点
Ⅱ型限制酶：
识别4-6个核苷酸
识别的核苷酸具有回文结构
可以形成平末端、粘末端
切口概率
星号活力
星号活力定义：
限制酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其特异识别的序列类似的序列的现象。
影响因素：甘油浓度过高，低离子强度，限制酶用量过大，高PH，有机溶剂污染
表示方法：在相应的酶上加星号表示。
如：EcoR Ⅰ（*）
如EcoRI切割后产生5′末端突出的粘性末端；
5′－G↓AATT C－3′ 5′－G-OH p-AATTC－3′
3′－C TTAA↑G－5′ 3′－CTTAA G－5′
PstI切割后产生3′末端突出的粘性末端：
5′－C TGCA↓G－3′ 5′－CTGCA-OH p-G－3′
3′－G↑ACGT C－5′ 3′－G ACGTC－5′
还有一些酶沿对称轴切割DNA，产生平端或钝端（blunt end）如SmaI:
5′－CCC↓GGG－3′ 5′－CCC GGG－3′
3′－GGG↑CCC－5′ 3′－GGG CCC－5′
Ⅱ型限制酶切口特点
1．异源同工酶（Isoschizomers）也称同裂酶:来源不同，识别顺序相同，切割方式可同可不同：
(1)识别顺序与切割方式同，如：
MboⅠ和 SauSⅠ（ －NN↓GATCNN-3′）
-NNCTAG↓NN-5′
(2)识别顺序同，切割位点不同，如：
SmaⅠ CCC↓GGG 和 XmaⅠ C↓CCGGG
(3)识别与切割相同，但其中一酶可以切“修饰”（***化*），另一酶不能。如：
HpaⅡ→CCGG 和 MspⅠ→CCG*G
MboⅠ→GATC 和 Sau 3A →GA*TC
几种特殊的内切酶
HpaⅡ CC↓GG SmaⅠ CCC↓GGG SmaⅠ的6个bp含HpaⅡ的4个bp顺序，所以HpaⅡ 能识别与切割SmaⅠ的6个bp，但含有HpaⅡ的ccgg的其它6核苷酸 顺序不能被SmaⅠ切割。
3．同尾酶
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。
BamHⅠ G GATC C BclⅠ T GATC A
C CTAG G A CTAG T
二．DNA连接酶
1. DNA连接酶： 大肠杆菌染色体编码
粘末端连接
NAD+供能
2. T4 DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码
粘末端、平末端连接
已知唯一平末端连接酶
ATP供能
DNA连接酶是基因工程重要的工具酶，常用T4DNA ligase.
（一）功能：催化有互补顺序的两个DNA分子的粘性末端或平头末端3’－OH、5’－P连接作用。
（二）来源－噬菌体T4感染E coli分离的一种单链多肽酶、。
（三）催化反应：
需要ATP、Mg2+作辅助因子；
对粘性末端催化活性大于平头末端
5′－G↓AATT C－3′ 5′－G－OH p-AATTC－3′
3′－C TTAA↑G－5′