文档介绍：分子克隆
有特定的识别序列
但切割位置远离识别位置
有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割DNA分子
在基因工程中没有什么用途
Ⅰ型限制酶
第二节 分子克隆常用的工具酶
8
Ⅲ型限制酶
有特定的29
反转录酶 reverse transcriptase
以RNA为模板，聚合形成cDNA链。
2. 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链
第二节 分子克隆常用的工具酶
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核酸酶S1
可以降解单链DNA和RNA。
降解单链DNA比降解双链DNA快75000倍。
降解单链DNA比降解单链RNA快7倍。
-.
第二节 分子克隆常用的工具酶
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核酸酶S1功能
内切单链DNA或RNA
内切带缺口或裂口的双链DNA或RNA
第二节 分子克隆常用的工具酶
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末端脱氧核苷酰转移酶
来自小牛胸腺
不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTP
第二节 分子克隆常用的工具酶
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碱性磷酸酶
来自小牛胸腺（CAP）
来自大肠杆菌（BAP）
功能：将DNA或RN***段的5`端的磷酸基切除
第二节 分子克隆常用的工具酶
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第三节 分子克隆常用的载体
为了能够在寄主细胞中进行繁殖，必须将DN***段连接到一种特定的、具有自我复制能力的DNA分子上。这种DNA分子就是基因工程载体（vector）。
载体的本质是DNA（少数为RNA）。
质粒（plasmid）
λ噬菌体的衍生物
动物病毒
细菌人工染色体
酵母人工染色体
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载体应具备的条件
能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组DNA分子
载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一个（置换型载体上被置换片段的两侧各有一个内切酶位点）
克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子
载体上要有报告基因或选择标记基因
在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切酶酶切位点
具有较高的外源DNA装载能力。
第三节 分子克隆常用的载体
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克隆载体—— 克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，使
克隆的DN***段数量大大增加
表达载体—— 将外源基因或DN***段在宿主细胞中表达蛋白质
插入型载体— 将外源基因或DNA插入其中
置换型载体— 切除载体部分DNA，代之以外源基因或DNA。
第三节 分子克隆常用的载体
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质粒
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主细胞染色体外而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。
绝大多数质粒是DNA型的，天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA。
基因克隆的载体质粒DNA分子都具有复制子、选择性标记、克隆位点。
第三节 分子克隆常用的载体
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质粒的命名
小写p代表质粒（plasmid），后接两个大写字母代表发现者或实验室，字母右方数字代表质粒的编号。
pBR322
质粒 F. Bovlivar 编号
第三节 分子克隆常用的载体
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质粒与宿主细胞的关系
（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存下去。
（2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。
（3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿主细胞的补偿（“交房租”）。
（4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关的，如抗生素抗性基因：
第三节 分子克隆常用的载体
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质粒发现和研究意义
1）理论意义 质粒能够复制、传递和表达遗传信息，从分子遗传学观点来看是一种有机体，是比病毒更原始的生命形式，是生命起源研究的起一块体重要基石。
2）实践意义 是基因工程的重要载体（vector），能把外源基因（目的基因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。
质粒是可以改造的，可以剪切、剪接的，基因工程的重要任务之一就是严格改造质粒的同时，控制质粒不传递，若一个致癌质粒可以传递就会传到处都是。
第三节 分子克隆常用的载体
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质粒的分类
，分为2类：
1）严谨控制型（stringent contrd type） 2）松弛控制型（relaxed control type）
(1)拷贝数少，一般<10个，分子量大； (1)拷贝数多，10-200个，分子量小；
(2)复制受限，受细菌宿主DNA复制系