文档介绍：酶蛋白的结构
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蛋白质结构和功能的关a溶于乙酸乙酯，Aa不溶
标准Aa + DNS——反应——纸层——荧光显色
未知DNS-Aa­——纸层——荧光显色
比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有几条肽链组成
c）优点：灵敏度高；是前种方法的100倍；用量少，-2ng
缺点：DNS-Pro、DNS-Try被破坏；N端是Pro、Try测不出；不能进行N端测序
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3) Edman降解法[苯异硫***酸酯法（PITC法)]
a) 原理：
a）分离检测：PTH-Aa溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯，Aa不溶
c）优点：N端是Pro可测；能进行N端测序
缺点：灵敏度稍差
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4）DansyCl-Edman法
既可检测N端序列又有较高灵敏度
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5) 亮氨酸氨肽酶法
此酶专一水解N端羧基形成的肽键，可测N端序列，但不能测N端为Pro.
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5-2 C-末端分析
C-末端分析方法也有很多，但至今还不能令人满意，常用的有肼解法、还原法、羧肽酶法等。
1）肼解法
原理：
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b）分离检测：
苯甲醛+酰肼→沉淀→离心
上清液中含游离基酸
2) 还原法
用还原剂如硼氢化锂处理肽链，则C-末端残基的α-羧基被还原成醇，将肽链完全水解后，分析水解产物，其中的α-氨基醇对应的即为C-末端氨基酸。
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3) 羧肽酶法
羧肽酶是一种专一从多肽链的C-末端开始逐个水解氨基酸残基的蛋白水解酶。由于该酶的专一性，当它作用于多肽链时，C-末端残基首先被水解下来，然后是C-末端第二个氨基酸残基，依此类推。根据氨基酸释放的动力学曲线，可以确定C-末端氨基酸以及靠近C-末端的几个氨基酸的排列顺序。不过这是理想的情况，实际测定中常常有多种因素干扰，很难确定C-末端多个氨基酸的排列顺序。
羧肽酶A：a）Lys、His、Arg在C-末端不能水解
b）C-末端是Pro不能水解
c）C-末端第二个是Pro，无论第一个是何氨基酸都不能水解
羧肽酶B：a）水解C-末端为Lys、His、Arg的
b）C-末端第二个是Pro，无论第一个是何氨基酸都不能水解
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在氨基酸顺序测定时，只要从肽链某一末端（通常是N-末端）起逐个将氨基酸残基断裂下来，并对游离出来的氨基酸或其衍生物进行鉴定，就可以确定氨基酸序列。但是实际操作时，由于每次末端氨基酸残基发生断裂的效率不能达到100%，或者说，在大多数肽段在断裂第二个氨基酸残基时，少数肽段可能因为上一轮未发生反应而正在断裂第一个氨基酸残基，这样势必给测定带来干扰。如果肽链很短，这样的干扰不会对测定产生重大影响；但蛋白质肽链的长度都超出这一范围，这样测定将无法进行下去。所以人们首先需将肽链进行适当的分解，将其断裂成若干长度合适的肽段，再分别测定这些肽段的氨基酸顺序。
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1．溴化***裂解法：
BrC≡N：专一水解Met羧基形成的键
优点：专一性强，切点少，产率高（85%）
* 弱酸、弱碱也可使肽链水解但专一性不好
2．酶解法：
胰酶：水解碱性氨基酸羧基所形成的键（Lys，Arg）
* 碱性氨基酸的羧基连接的是Pro则不能水解。
糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：专一性水解芳香族氨基酸羧基所形成的键（Phe，Try，Tyr）。
* 若芳香族氨基酸的羧基连接的是Pro则不能水解。
分离肽链可用：分子筛；离子交换；等点聚焦（电泳法）
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7. 测定各个肽段的氨基酸顺序
测定肽段的氨基酸顺序的方法有：Edman降解法、酶解法、气相色谱－质谱联用法等，其中最常使用的是Edman降解法。
Edman降解法的原理是利用前述苯异硫***酸酯（PITC），又称Edman试剂与N-末端氨基酸残基的α-氨基之间的特异性反应，每轮反应后N-末端氨基酸脱落，并生成PTH-氨基酸。通过层析等方法鉴定PTH-氨基酸的种类，就可以确定肽链中对应位置的氨基酸。通过n轮反应，即可确定由肽段中N-末端起n个氨基酸的顺序。
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