文档介绍：关于分子克隆
第一张，共二百张，创建于2022年，星期二
第一节
概 述
第二张，共二百张，创建于2022年，星期二
基因工程（gene engineering ）：
将基因进行克隆，，1980年Roberts在此基础上进行了系统分类
①限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus);第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)。
②第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)。
③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。
第十六张，共二百张，创建于2022年，星期二
限制性核酸内切酶的命名原则：
属名 种名 株名
Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株
HindⅡ HindⅢ
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
第十七张，共二百张，创建于2022年，星期二
EcoR I
产生该酶的
宿主菌属名
微生物的种名
宿主菌的株或型
同一菌株中不同限制酶的编号（按发现先后顺序）
第十八张，共二百张，创建于2022年，星期二
Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用
识别双链DNA特异的核苷酸序列，通常48个碱基对
在识别序列特定的位点上精确切割双链DNA分子
第十九张，共二百张，创建于2022年，星期二
Ⅱ型限制酶的识别和切割位点
特点：4-8个bp，具有回文结构的DN***段
1、粘性末端：在识别序列的两个对称点切开DNA双链，产生带单链尾的粘性末端
2、平末端：切割点是识别序列的对称轴，产生平端或钝端(blunt end)。
第二十张，共二百张，创建于2022年，星期二
第二十一张，共二百张，创建于2022年，星期二
第二十二张，共二百张，创建于2022年，星期二
特殊性质的Ⅱ型限制酶：
（1）同裂酶：又称同工异源酶，是从不同的原核生物中分离出来的不同的酶。它们识别相同的序列，在切割DNA时，其切割点可以是相同的，也可以是不同的。
例如：Aha Ⅲ和DraⅠ的识别和切割序列都相同，产生平端：
第二十三张，共二百张，创建于2022年，星期二
KpnⅠ和Asp718Ⅰ的识别位点相同，但切割位点不相同，前者产生3'粘性末端，而后者产生5'粘性末端
第二十四张，共二百张，创建于2022年，星期二
（2）同尾酶：有些限制酶的识别序列不同，但是它们作用后产生相同的粘性末端，故称为同尾酶。
例如MboⅠ、BamHⅠ、BglⅡ的识别切割序列分别为：
第二十五张，共二百张，创建于2022年，星期二
(1)DNA样品的纯度
DNA样中混有蛋白质、苯酚、***仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。
可采用以下方法，提高酶活性：
加大酶的用量
加大反应总体积
延长反应时间
限制性核酸内切酶反应影响因素
第二十六张，共二百张，创建于2022年，星期二
(2)DNA样品的***化程度
大肠杆菌中的dam***化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌呤N6位引入***，受其影响的酶有BclI 等。
大肠杆菌中的dcm***化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入***，受其影响的酶有EcoRII等。
采用去***化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止DNA的***化。
第二十七张，共二百张，创建于2022年，星期二
(3) 酶切反应的温度
多数标准反应温度是37℃，特殊如SmaI为25℃或30℃ ，SfiI为50℃ 。
反应温度过高或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。
(4)DNA分子结构
某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性DNA时高出多倍，可高达20倍。
第二十八张，共二百张，创建于2022年，星期二
(5)核酸内切酶的缓冲液
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性”现象。
第二十九张，共二百张，创建于2022年，星期二
限制酶的主要用途：
第三十张，共二百张，创建于2022年，星期二
限制性核酸内切酶在分子克隆中的用途：
切割DNA以获取目的DN***段
切割载体DNA形成切口
使目的DN***段能插入载体
第三十一张，共