文档介绍：酶蛋白的结构
第一节蛋白质一级结构研究方法
1. 蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定

3. 拆分并分离蛋白质分子的多肽链
4. 测定每条多肽链的氨基酸组成
5. 多肽链的N-末端和C-末端分析
氨基酸残基断裂下来，并对游离出来的氨基酸或其衍生物进行鉴定，就可以确定氨基酸序列。但是实际操作时，由于每次末端氨基酸残基发生断裂的效率不能达到100%，或者说，在大多数肽段在断裂第二个氨基酸残基时，少数肽段可能因为上一轮未发生反应而正在断裂第一个氨基酸残基，这样势必给测定带来干扰。如果肽链很短，这样的干扰不会对测定产生重大影响；但蛋白质肽链的长度都超出这一范围，这样测定将无法进行下去。所以人们首先需将肽链进行适当的分解，将其断裂成若干长度合适的肽段，再分别测定这些肽段的氨基酸顺序。
1．溴化***裂解法：
BrC≡N：专一水解Met羧基形成的键
优点：专一性强，切点少，产率高（85%）
* 弱酸、弱碱也可使肽链水解但专一性不好
2．酶解法：
胰酶：水解碱性氨基酸羧基所形成的键（Lys，Arg）
* 碱性氨基酸的羧基连接的是Pro则不能水解。
糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：专一性水解芳香族氨基酸羧基所形成的键（Phe，Try，Tyr）。
* 若芳香族氨基酸的羧基连接的是Pro则不能水解。
分离肽链可用：分子筛；离子交换；等点聚焦（电泳法）
7. 测定各个肽段的氨基酸顺序
测定肽段的氨基酸顺序的方法有：Edman降解法、酶解法、气相色谱－质谱联用法等，其中最常使用的是Edman降解法。
Edman降解法的原理是利用前述苯异硫***酸酯（PITC），又称Edman试剂与N-末端氨基酸残基的α-氨基之间的特异性反应，每轮反应后N-末端氨基酸脱落，并生成PTH-氨基酸。通过层析等方法鉴定PTH-氨基酸的种类，就可以确定肽链中对应位置的氨基酸。通过n轮反应，即可确定由肽段中N-末端起n个氨基酸的顺序。

至此，已经得出了多肽链被断裂成的各个肽段的氨基酸顺序，但由于没有这些肽段在多肽链中次序的信息，还是无法排出整个多肽链的氨基酸顺序。为此，必须用两种或者两种以上的方法来断裂多肽链，比如用两种蛋白酶分别水解多肽链，将得到两套断裂位点不同的肽段，分别确定这两套肽段的氨基酸顺序，然后利用这两套肽段的氨基酸顺序彼此之间有交错重叠，可以确定整条多肽链的氨基酸顺序。
通过末端分析得到：N-末端残基为I，C-末端残基为L
用胰蛋白酶水解得到第一套肽段，测定出氨基酸顺序分别为：
MTYAGK ISR EAL CAFR DALK
用胰凝乳蛋白酶水解得到第二套肽段，测定出氨基酸顺序分别为：
TY REAL AGKDAL ISRM KCAF
由于N-末端残基为I，ISR和ISRM是N-末端肽段；又由于C-末端残基为L，EAL和REAL是C-末端肽段。利用两套肽段的氨基酸顺序彼此之间的重叠关系，得出：
第一套肽段： N-末端 ISR MTYAGK DALK CAFR EAL C-末端
第二套肽段： N-末端 ISRM TY AGKDAL KCAF REAL C-末端
推出完整肽链顺序：
ISRMTYAGKDALKCAFREAL
在上例中，两套肽段之间正好能够相互跨过切口而重叠，从而能确定出肽段在多肽链中的位置，拼凑出整条肽链的氨基酸顺序。
9. 多肽链中二硫键位置的确定
对于含有二硫键的蛋白质，我们在分析多肽链氨基酸顺序前先将其拆开，然而在测定完多肽链氨基酸顺序后需要确定链内和链间二硫键的位置，常用的方法是对角线电泳法。不拆开二硫键直接用蛋白酶水解蛋白质，所得肽段样品点样到滤纸中央的电泳原点，在第一个方向上进行电泳，则不同的肽段按其所带电荷和分子大小分离。结束后将滤纸在过甲酸蒸气中熏，二硫键被氧化和拆开。将滤纸旋转90°，在相同条件下进行第二个方向上的电泳。这时，对于不含二硫键的肽段，由于没有发生变化，电泳迁移率不变，电泳后位置应处于对角线上；而含有二硫键的肽段，其大小和电荷发生了变化，电泳迁移率也要改变，电泳后位置偏离对角线，将这些肽段提取出来，进行氨基酸顺序分析，与已经测定的多肽链氨基酸顺序相比较，即可推断出二硫键的位置。
除了上述经典的蛋白质一级结构测定方法外，由于核苷酸序列测定技术发展迅速，目前DNA的核苷酸序列测定已完全实现自动化，而蛋白质的氨基酸顺序是由DNA所决定的，人们通过提纯指导蛋白质合成的mRNA，再将mRNA通过逆转录作用得到cDNA，并扩增cDNA，然后测定其核苷酸序列，根据三联体遗传密码规则可确定出蛋白质的氨基酸顺序。
到目前为止，已有10万种以上的蛋白质完成了