文档介绍：细胞组分的分析 DNA,RNA 碱性磷酸酶多糖脂
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第二节细胞组分的分析方法
形态学观察与细胞成分分析相结合是当代细胞生物学研究中常常采用的实验方法。它为揭示生物大分子在细胞内的构建相互关系及细胞内的功能方面提供了有力的工具。
一、用超离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物
用低渗匀浆、超声破碎、或研磨等方法可使细胞质膜破损,形成细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器和细胞组分的混合匀浆,再通过差速离心,即利用不同的离心速度所产生的不同离心力,将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。
密度梯度离心是将要分离的细胞组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的高溶解性的惰性物质(如蔗糖),形成密度梯度溶液的表面。在这种条件下进行离心,不同组分以不同的沉降率沉降,形成不同的沉降带。各组分的沉降率与它们的形状和大小有关,通常以沉降系数(S值)表示。超离心机可达8×104r/min,产生50万倍重力场。在这巨大离心力的作用下,甚至相当小的tRNA(沉降系数4S)和单一的酶都可根据其沉降系数相互分离开。差速离心与密度梯度离心相结合可以达到更精细的分离(图3-10)。
二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法
为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂类等细胞组分,通常利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征,通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。
例如福尔根(Feulgen)反应可以特异显示DNA的分布:酸水解可以去除RNA,仅保留DNA,并除去DNA上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤,使脱氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基与希夫(Schiff)试剂反应呈紫红色。PAS反应则可确定多糖的存在,其原理同样是利用希夫试剂与醛基之间的反应,这时的醛基来自过碘酸氧化多糖的“1,2-乙二醇”基,使醛基释放。因为多糖类物质都能产生PAS反应,所以可以用不同方式改进其反应特异性。
四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色,用以证明脂肪滴的存在。苏丹Ⅲ(深红色)通过扩散进入脂滴中,使脂滴着色。苏丹黑也溶于磷脂和胆固醇中,产生较大的颜色反差。
样品中的蛋白质成分也有多种检测方法。在米伦(Millon)反应中,氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的酪氨酸残基反应,形成红色沉淀。在重氮反应中,氢氧化重氮与酪氨酸、色氨酸和组氨酸起反应形成有色的复合物。蛋白质中的—SH 基可用形成硫醇盐共价键的试剂进行检测。
由于大多数固定剂对酶都有钝化作用,所以,在进行细胞中某种酶的定性研究时,样品制备或采用冰冻切片,或以冷丙酮、甲醛进行短期固定,以尽量保持酶的活性,然后将样品(细胞或组织切片)与适宜底物共同温育。例如检测碱性磷酸酶的格莫瑞(Gomori)方法,是用甘油磷酸酯作底物,由于酶水解释放的磷酸根,在钙离子存在的情况下转变成不溶性的磷
酸钙,进而转变成金属银或硫化铅、硫化钴或其它有颜色的化合物,金属沉淀或颜色的存在部位,即碱性磷酸酶存在的活性部位。
图3-10 差速离心结合密度梯度离心分离细胞组分示意图
三、特异蛋白抗原的定位与定性
二十世纪70年代以来,免疫学的迅速发展为细胞生物学的研究提供了强有力的手段,特别是在细胞内