文档介绍：分子克隆技术
实验报告
题目:
分子克隆技术实验报告
姓名:
周仁杰
学号
2008305201816
班级:
08级张之洞班
指导教师:
李香花练兴明
中国·武汉
二○一一年四月
分子克隆技术
将M812载体上的水稻DN***段亚克隆至pUC19载体上
摘要:
利用碱裂解法抽提质粒pUC19和M812载体上的水稻DN***段,在用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量后,将亚克隆载体pUC19与外源DNA进行限制性内切酶消化,然后回收目的片段。载体与外源DNA连接后,将DNA重组分子导入感受态细胞大肠杆菌菌株DH5a,均匀涂布到AMP抗性培养基上让其生长,筛选出转化子。
关键词: 质粒载体克隆重组转化琼脂糖凝胶电泳
前言:
质粒是携带外源基因进入宿主细胞、扩增或表达外源基因的主要载体,它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多,大多包括3个主要步骤:细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例,介绍质粒的抽提过程。
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多,应用非常广泛,它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为分离和鉴定核酸的常用方法。-,核酸分子带负电,在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
DNA重组技术包括载体及外源DN***段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、母的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DN***段的克隆技术是分子操作的核心部分。而其中,载体的作用尤为重要,载体必须具备三个条件:,载体在受体细胞中能大量繁殖,其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增;,便于外源基因的插入;(如抗生素抗性标记等)以此知道它是否已进入受体细胞,并据此标记将携带载体的细胞从其他细胞中分离出来。
本实验采用CaCl2法制备感受态细胞:利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞,可以诱导其产生短暂的“感受态”,易于摄取外源DNA。转化效率为106 ~ 107转化子/mg DNA。
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中,实现重组克隆的增殖,便于后续分子操作。
材料及方法:
***段的M812载体的大肠杆菌菌液。
:携带pUC19质粒载体的大肠杆菌和携带含有水稻DN***段的M812载体的大肠杆菌德培养先采用含相应抗生素的LA培养基,后采用LB培养基。大肠杆菌菌株DH5a采用LB培养基。大肠杆菌在37℃培养。
:氨苄青霉素,100µg/ml;卡那霉素,50µg/ml。
2. 实验步骤
质粒的制备
1. ,12000g 1min,倒掉菌液; ml菌液,再次收集菌体,尽量将菌液倒干净;
2. 加入300ml 溶液 I,振荡打匀,重新悬浮细胞,震荡混匀(注意:应彻底打匀沉淀或碎块);
加入300ml 溶液II,轻柔颠倒混匀,放置至清亮,一般不超过5分钟(最好不超过2分钟);
加入300ml 溶液III颠倒混匀,放置于冰上10分钟,使杂质充分沉淀;
5. 12000 g离心10分钟;
6. 吸取800ml 上清液(注意:不要吸取到飘浮的杂质)至另一Eppendorf管中,加入2/3体积的异丙醇,室温下放置5分钟;
12000 g 常温离心15分钟;
倒尽上清,加500 ml 75%乙醇浸洗除盐,(放置片刻后倒去上清;或离心5分钟)
加40ml 灭菌超纯水或TE溶解;
质粒的质量检测,-20℃保存。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中,水平放置在工作台上,调整好梳子的高度;
g琼脂糖于30 ml ×TBE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至温热时倒胶;
凝胶凝固后,小心拔去梳子;
4. 将DNA样品与上样缓冲液混合后将样品依次加入点样孔中(上样缓冲液含甘油或蔗糖,利于DNA样品沉入点样孔中;含有电泳指示剂,以指示电泳的进程);
将制胶板放入电泳槽中,加入电泳液,打开电泳仪,使核酸样品向正极泳动(注意点