文档介绍：核酸的理化特性
及
核酸的制备、检测
核酸的一般理化性质
1. DNA 的酸碱及溶解度性质
DNA 有磷酸和碱基,为***大分子,但偏于酸性
可与金属离子成盐,不溶于乙醇或异丙醇
2. DNA的高分子性质
粘度: DNA > RNA;dsDNA > ssDNA
沉降行为:溶液中的核酸分子在引力场中可以下沉
3. 在室温条件下,DNA 在碱中变性,但不水解,RNA水解。
嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键,使核苷、核苷酸及核酸可以吸收紫外光,最大吸收峰位于 260 nm 附近。
用紫外分光光度计测定 DNA 和 RNA 在 260 nm 处的光密度值(optical density, OD 值) 来定量 DNA 和 RNA。
OD260:单核苷酸> ssDNA > dsDNA
核酸的紫外吸收
当下列溶液的浓度为 50 g/ml 时:
dsDNA A260 =
ss DNA A260 =
单核苷酸 A260 = 增色效应(hyperchromic effect)
收获携带质粒的大肠杆菌
将菌体悬浮在溶液 I (50 mM Tris-Cl, pH ; 10 mM EDTA; 100 g/ml RNase A) 中
加溶液 II (200 mM NaOH; 1% SDS),5 分钟
加溶液 III (3 M KAc, pH )
离心后取上清, 加入等体积的酚/***仿/异戊醇
离心后取水相, 加
离心后得到 DNA 沉淀, 用 70%乙醇洗涤 DNA 沉淀
空气干燥 DNA 沉淀, 将 DNA 溶解在
TE (10 mM Tris·Cl, pH ; 1 mM EDTA, pH ) 或 ddH2O 中
质粒 DNA 的制备(常规方法)
悬浮细胞
用 SDS 和 NaOH 裂解细菌,基因组 DNA 及质粒 DNA 发生变性,而质粒 DNA 从细胞中释放出来。
用 KAc 中和 NaOH,质粒 DNA 迅速复性并恢复天然的超螺旋结构; 染色体 DNA 难于复性并与细胞碎片一起沉淀下来。
质粒 DNA 制备试剂盒
(1) A260/A280 值
A260:测定质粒 DNA 在 260 nm时的光吸收值
A280:测定质粒中所污染的蛋白质在 280 nm 时的光吸收值
A260/A280 值表示质粒的纯度:
当 A260/A280 时表示质粒较纯。
质粒 DNA 浓度= A260 x 50 g/ml x 稀释倍数
质粒的鉴定
(2) 质粒的电泳
建立基因组文库;
克隆特定的基因;
用 PCR 反应检测基因的存在及突变等;
用 Southern 印迹检测某一基因的存在和拷贝数;
用 Southern 印迹进行 RFLP 分析;
SNP 分析
可从细菌、细胞或组织中制备基因组 DNA,可用于:
基因组 DNA 的制备