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宣布
申请
种类
专利申请CN7634号
公开
2009年6月24日
日
申请
2009年1月7日
日期
优先
2009年1月7日
权日
公开
,CN2A,CN2A,CN7634,CN-A-2,CN2A,CN2A,CN7634,
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发明
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用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法CN2A大纲本发明涉及一种可用于美容、护肤的干细胞分泌因子的制备方法。包括细胞分别、干细胞的扩增、干细胞因子系统的获得和浓缩、积蓄获得含有干细胞活性因子系统。该系统包括目前已判断的各型干细胞所分泌的活性因子。本发明所得的干细胞活性因子系统中不含外来的培养液成分，也不含有死细胞裂解成分。并可以长远保存而保持组织和细胞修复生
性。使干细胞美容真切从理想走向了现实。在生物医学的深度对传统美学看法进行了提升。同时该发明简单易行，合适于大规模生产，为干细胞服务于美丽事业供应了一条捷径。权益要求(6)1、一种用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法，其特色在于包括的步骤：分别干细胞：从人或哺乳动物相应组织中分别出干细胞；2)干细胞的扩增，用相应干细胞的常例培养方法，包括a-MEM培养基，加入10％的胎牛血清，5％CO2，
37℃条件下培养，如期换液，传代，进而获得所需数量的干细胞；3)干细胞因子系统的获得：在干细胞分裂最旺盛的时期，弃去正常培养基，用PBS缓冲液(磷酸缓冲液，pH＝左右)冲洗1-3次，今后加入PBS或生理盐水，细胞培养箱中培养4-24小时，收集上清液，即可获得富含干细胞生长因子系统的溶液；4)浓缩、积蓄：所得液体离心，除去散落细胞，浓缩，按1×106个细胞/毫升的浓度进行浓缩，得产品，可于-20℃长远保存，以备使用。2、依照权益要求1所述的方法，其特色在于所述的本源于干细胞所分泌的干细胞因子系统，该系统包括该系统包括干细胞因子、内皮细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子肝细胞生长因子、神经生长因子、纤维母细胞生长因子、胰岛素样成长因子、粒细胞集落刺激因子、白细胞介素；其他，干细胞分泌因子中还含各型胶原蛋白，包括I、II、III、IV型胶原蛋白，以及各种溶菌酶。3、依照权益要求1所述的方法，其特色在于所述的千细胞因子系统是指：本源于人或哺乳动物胚胎干细胞、脐血干细胞、骨'髓千细胞、表皮干细胞、内皮干细胞、外周血干细胞、脂肪干细胞，也可泛指所有的干细胞。4、依照权益要求1所述的方法，其特色在于所得的产品作为活性成分配以医学上接受的溶解液构成组合物的产品，直接用于美容、护肤，包括、美容、祛斑、修复疤痕。5、依照权益要求1所述的方法，其特色在于所得的产品作为活性成分可以增加到各种制剂的美容护肤产品中，包括除皱、美容、祛斑、修复疤痕。6、依照权益要求1所述的方法，其特色在于所得的产品用于美容、护肤产品中的针剂、面霜、乳液、水液制剂，包括干净霜、干净乳、干净皂、面膜、化妆水、按摩膏、乳液、营养霜、关容霜、粉底或粉饼。说明
用于美容护肤的干细胞分泌因子的制备方法
技术领域
本发明涉及一种可用于美容、护肤的干细胞分泌因子的制备方法。该干细胞分泌的复合因子，可被应用于美容化妆品、保健品、护肤品。背景技术
干细胞是一种拥有多向分化潜能的细胞，依照本源的不同样样可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞可以分化为身体的任何一种细胞，所以也叫全能干细胞。成体干细胞是指那些拥有组织或器官特异性的干细胞，能在合适的环境中分化成与其定位合适的细胞系，又称为多能干细胞。干细胞在特定的环境中可以定向分化，进而达到修复组织和细胞损害的作用。本发明者研究表示（Bcl-2engineeredMSCsinhibitedapoptosisandimprovedheartfunction',StemCells,2007Aug;25(8):2118-27..)干细胞可以经过分化为特定的细胞来修复组织，而旁分泌作用在组织的修复中发挥了更大的作用。也就是说，在
千细胞治疗组织损害的时候，干细胞分泌的细胞因子发挥了极为重要的作用。该系统包括干细胞因子（SCF)、内皮细胞生长因子（VEGF)、表皮细胞生长因子（EGF)、肿瘤坏死[刮子（TNF)肝细胞生长因子（HGF)、神经生长冈子（NGF)、纤维母细胞生长因子(F〔;F)、胰岛素样成长因子（IGF)、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、白细胞介素（IL)等20余种。其中干细胞因子（StemCellFactor,SCF)不不过保持生命活动所需要的，而且在抵抗电离辐射对机体的作有及修复辐射所致损害中都是必不可以少的。其他，干细
胞分泌因子中还含各型胶原蛋白（如i、ii、m、[V型胶原蛋白）以及各种溶
菌酶等。
表皮千细胞是皮肤更新的种子细胞。每天都有大量的表皮细胞死亡零散，也会有相应数量的再生细胞加以补充。随着人们年龄的增加，皮肤出现斑点，皱纹也逐渐增加，表皮失去了往昔的光彩，这所有皆源于表皮干细胞再生能力的减退，如何使表皮干细胞保持旺盛的新陈代谢能力，将是保持皮肤健康美丽的要点所在。
基于人们对美丽的需求，干细胞美容技术及其相关产品的丌发R益碰到业界的重视。目前市场上出现了很多所谓的干细胞产品，从技术角度上其实不具备推行的可行性。中国专利CN1817339A、N1872025A和CN1817339A专利涉及产品的内容使用了活性干细胞和中药组分，第一如何在护肤品种保持干细胞的活性？其次如何防备干细胞坏死后产生毒素对人体的损害？这些都是值得商议且很难以解决的问题。CN1872025A采用细胞破碎技术，以及正常状态下的细胞培养技术来获得干细胞活性组分。这种获得干细胞活性组分的方法缺乏依照。就如你砍碎了苹果树你其实不会获得苹果？粉碎了细胞可是获得了细胞片断。常例来讲在正常生长状态下，所获得的细胞培养上清液，上清液中包括更多的是代谢废物，同时采用a-MEN(其中增加有激素如地塞米松）培养基，如何有效除去其中的激素，都是其所面对的问题。
3目前市场上也有在芙容护肤产品中增加生长因子如bFGF和EGF的，而细胞的更新是一个系统的过程，单一世长因子的增加在某种程度上虽可以刺激细胞的代谢，但也简单造成依赖性。
综上可以看出，基于干细胞的美容疗法拥有广阔的远景，但如何科学、有效地利用干细胞的独到性能，开发出真切意义上的干细胞美容护肤产品，仍让是一个崭新的课题。
发明内容
本发明的目的在于供应一种用于关容护肤的干细胞分泌因子的制备方法，干细胞分泌因子可用于关容护肤的产品。
本发明供应的用于关容护肤的千细胞分泌因子的制备方法包括的歩骤：
采用常例的细胞分别方法，从人或哺乳动物相应组织中分别出干细胞。
干细胞的扩增，用相应干细胞的常例培养方法，包括a-MEM培养基，加入10%的胎牛血清，5%C02，37'C条件下培养，如期换液，传代，进而获得所需数量的干细胞。
干细胞因子系统的获得：在干细胞分裂最旺盛的时期，弃去正常培养基，用PBS缓冲液（磷酸缓冲液，pt^左右）冲洗l-3次，今后加入PBS或生理盐水，细胞培养箱中培养4-24小时。收集上清液，即可获得富含干细胞生长因子系统的溶液。
4)浓缩、积蓄：所得液体离心，除去散落细胞，浓缩，按
lXl( )"
个细胞/ml
的浓
度浓缩，得产品，于-2(TC长远保存，以备使用。
本发明所述的本源于干细胞所分泌的干细胞因子系统，该系统包括干细胞因子
(SCF)、内皮细胞生长因子（VEGF)、表皮细胞生长因子（EGF)、肿瘤坏死因子（TNF)肝细胞生长因子（HGF)、神经生长因子（NGF)、纤维母细胞生长因子（FGF)、胰岛素样成长因子（K;F)、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、白细胞介素（IL)等。其他，干细胞分泌因子中还含各型胶原蛋白（如I、II、III、iV型胶原蛋白）以及各种溶菌酶等。
本发明所述的干细胞因子系统是指：本源于人或哺乳动物胚胎干细胞、脐血干细胞、骨髓干细胞、表皮干细胞、内皮干细胞、外周血干细胞、脂肪干细胞等，也可泛指所有的干细胞。
本发明所得的产品作为活性成分配以医学上接受的溶解液构成组合物的产品，直接用于美容、护肤方面的用途，包括除皱、美容、祛斑、修复疤痕等。
本发明所得的产品作为活性成分可以增加到各种制剂的美容护肤产品中。用于美容、护肤方面的用途，包括除皱、芙容、祛斑、修复疤痕等。
本发明所得产品可以用于美容、护肤产品中的针剂、面霜、乳液、水液或常用化妆品中的各种制剂，以及依照用途分类的护肤及关容的各种产品，包括但不限于干净霜、干净乳、干净皂、面膜、化妆水、按摩膏、乳液、营养霜、美容霜、粉底或粉饼等。
本发明所得的干细胞活性因子系统中不含外来的培养液成分，也不含有死细胞裂解成分。并可以长远保存而保持组织和细胞修复生性。本发明利用干细胞多向分化和兴隆的自我复制能力，体外大量扩增干细胞。依照干细胞复合因子系统拥有促进表皮干细胞增殖、促进皮肤新陈代谢，增强皮肤细胞的活力，促进细胞物质成分交换的作用，来增强皮肤对其他营养物质的吸取，以及机体内代谢废物的排放。采用干细胞在无血清条件下的分泌效应，获得不含细胞培养基和细胞组分的干细胞因子复合系统。由于本发明不含外来培养基和细胞组分，进而防备了外来增加剂和细胞裂解毒素对皮肤造成的损害。使干细胞美容真切从理想走向了现实。在生物医学的深度对传统美学看法进行了提升。同时该发明简单易行，合适于大规模生产，为干细胞细胞服务于美丽事业供应了一条捷径。
详尽推行方式推行例l
小鼠胚胎干细胞：本源于南丌大学生物中心
ES细胞的培养与扩增:取lml胚胎干细胞(embryonicstemcell,ES)，细胞浓度约为1X10"个细胞A)]，注射器或吸管吹打数次，以保证为单细胞悬液，将细胞铺于有原代小鼠胚胎成纤维细胞（Mt:F)的培养瓶中，ES保持培养基（天津联呈生物技术有限公司）10inl培养，过夜培养后更换培养液，2-3天后，消化、传代，再培养。屡次以上操作，以获得足够数量的ES。
干细胞活牲因子的制备：在ES细胞生长最旺盛时（约长满培养瓶70-80%面积），弃去培养基，用PBS(或生理盐水）冲洗2-3次，今后加入10mlPBS，连续培养24小时。取上清，离心，得富含干细胞因子系统。
细胞消化、计数：用磷酸缓冲溶液（PBS)轻轻冲洗培养瓶中细胞1一2次，增加3ral消化液（025%胰蛋白酶、002%RDTA)，37。C保温2-3分钟，显微镜下观察细胞己经分别，加入含血清DMEM培养基，吹散细胞，1500转/分钟离心5分钟，弃上清，加入5mlPBS，充分吹散细胞，进行细胞计数，按lml上清液/lX10"
个细胞的浓度浓缩上清液。
干细胞复合活性因子的保存：将以上浓缩后的上清液（一次或多次合并），置-2(TC冰箱，可长远保存，备用。
推行例2
本推行实例供应了骨髓本源的干细胞因子系统的制备过程，详尽以下：：取健康人骨髓10ml，PBS稀释至20ml，经过Ficoll密度梯度离心获得骨髓单核细胞，依照MSCs拥有倾向于粘附在聚苯乙烯表面上的特色，使MSCs与造血细胞分别。培养3天今后开始出现小的细胞集落。约7-9天后细胞达到饱和，此时进行传代。传代3h后细胞即圆满贴壁，2天后，细胞表现典型的成纤维细胞样形态，均匀分布在培养瓶内。3—4天后细胞密度即达到80—90%。：细胞密度达到80—90%时，用磷酸缓冲溶液（PBS)轻轻冲洗培养瓶中细胞1一2次，增加3ml消化液（025%胰蛋白酶、002%RDTA)，37。C保温2-3分钟，显微镜下观察细胞已经分别，加入含血
清a-MEM培养基，吹散细胞，按1瓶细胞传代3瓶的比率进行传代，2天后更欢培养液，再细胞密度达到80_90%时，屡次以上操作，以获得足够数量的骨髓干细胞。
干细胞活性因子的制备：在骨髓间充质干细胞生长最旺盛时（约长满培养瓶70-80%面积），弃去培养基，PBS或生理盐水冲洗2-3次，今后加入10mlPBS，连续培养24小时。取上清，离心，得富含千细胞因子系统。消化细胞，进行细胞计数，按lml上清液/1XIO"个细胞的浓度浓缩上清液。
干细胞复合活性因子的保存：将以上浓缩后的上清液（一次或多次合并），置-20'C冰箱，可长远保存，备用。
推行例3
本推行例供应了表皮干细胞活性因子系统的制备过程，详尽以下：
细胞本源：本源于健康人的皮片（或再生儿包皮）。
细胞的分别培养方法：按常例方法进行培养，详尽可参照（拜会张卓然主编的《培养细胞学与细胞培养技术》）。
干细胞活性因子的制备：在表皮干细胞生长最旺盛时（约长满培养瓶70-80%面积），弃去培养基，PBS或生理盐水冲洗2-3次，今后加入10m:lPBS，连续培养24小时。取上清，离心，得富含干细胞因子的上清液。消化细胞，进行细胞计数，按lml上清液/lXl(T个细胞的浓度浓缩上清液。
干细胞复合活性因子的保存：将以上浓缩后的上清液（一次或多次合并），置-2(TC冰箱，可长远保存，备用。
推行例4
推行例4、干细胞分泌因子在化妆品中的应用，将干细胞因子系统浓缩液，以1-10: