重组人胸腺素α1基因在黄芪毛状根中的表达.docx

文档介绍：重组人胸腺素α1基因在黄芪毛状根中的表达
作者:范伟全包晓群韩树海刘永刚张宏桂 
【摘要】 目的利用黄芪毛状根表达人胸腺素α1。方法合***胸腺素α1基篼因,构建重组载体pCAM滑BIA1301hTα1舾,以黄芪下胚轴为外植体,棺通过发根农杆菌C58C1寇介导转入黄芪毛状根中,取瑞潮霉素抗性毛状根用PCR法检测人胸腺素α1基因的伫整合,SDSPAGE、功Western印迹法分析人胸腺素α1基因的表达。结果潮霉素抗性毛状根整合秀并表达了人胸腺素α1基因铆。结论重组人胸腺素α1基岸因在黄芪毛状根中能够表达腽,为以黄芪毛状根为生物反拶应器工业化生产人胸腺素α绡1提供了实验基础。
【关讣键词】 人胸腺素α1;黄袢芪毛状根;发根农杆菌;重组载体
人胸腺素α1(h低umanthymosin∏alpha1,hTα1)孔是一种强力的免疫增强剂,氨主要用于自身免疫性肝病、骰原发性免疫缺陷、慢性乙型硪肝炎、丙型肝炎、黑素瘤、诩艾滋病及某些癌症、男性不粘育症、动脉粥样硬化等免疫懂缺陷病、免疫抑制性疾病及病毒病和肿瘤的治疗,具有囫良好的临床疗效〔1,2〕卷。本研究首先构建植物双元榻表达载体pCAMBIA1癫301hTα1,然后通笞过发根农杆菌C58C1介镛导转入黄芪毛状根中,最终
礓在黄芪毛状根中表达人胸腺钍素α1,从而建立以毛状根音作为生物反应器生产hTα薄1的方法。
1 材料与方沈法
 材料
 
黄芪种子揩由中国草地研究所提供;发尜根农杆菌C58C1和质粒嘈pCAMBIA1301载体由东北林业大学生命科学院惠赠;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成蚤,限制性内切酶和连接酶购⒐自大连宝生物公司,Western印迹法分析和其他驴试剂均购自北京鼎国生物技企术公司。
 方法
载体p禾CAMBIA1301h怀Tα1的构建 
合成带碱性磷酸酶信号肽的hTα1橹基因片段,5′端引入Nc瘊oI位点,3′端引入Bs娉tbI位点。摇菌提质粒后孪用NcoI和BstbI酶膺切,回收目的片段后连接至竺pCAMBIA1301载怀体上。转化感受态,提取质§粒用NcoI和BstbI陆酶切,切下150bp片段概,鉴定载体构建的正确性。
 制备工程菌 
制备发根梁农杆菌C58C1感受态细背胞,用载体pCAMBIA荨
1301hTα1转化感所受态细胞,涂板,37℃倒蛇置培养12~16h,挑取迈单个菌落,提取质粒,1%勹琼脂糖凝胶电泳鉴定后冻存岘菌种备用。
 转化黄芪毛状根
 培养黄芪无菌苗 
清洗黄芪种子2次,在70蛙%乙醇中浸泡1min,用绡无菌水冲洗3次,然后用%摁升***进行表面消毒8min酝后,用无菌水浸洗5次,每花次2min。接种在不含激素的MS培养基上进行无菌岂萌发,置于(25±1)℃ろ植物气候培养箱中,4~7蜴d后萌发长出无菌苗。
 怯培养工程菌
将发根农杆菌伯在YEB平板上划线培养。睦挑取单菌落接种于YEB液砝体培养基中,28℃,20箐0r/min条件下振荡培柢养,至OD600为~时按蜞1%量接种于新鲜YEB培蚨养基,添加乙酰丁香***10圻0μmol/L,继续培养篡至OD600为~时用于侵染。
 侵染转化毛状根 胬
将无菌苗的胚轴纵向划出趺刀痕,注入工程菌液,1w邹左右即可长出毛状根,除菌,潮霉素抗性筛选,最终获