文档介绍：《生化工程》课程实验
猪胰蛋白酶的分离纯化 与检测
主要内容
实验内容
实验目的
实验原理
实验方法
实验结果
实验报告格式
实验内容
一、猪胰蛋白酶的分离纯化
二、蛋白质含量的测定
三、酶活力的测定
四、纯化效果检测
——SDS-PAGE电泳检测
实验目的
1、掌握盐析沉淀法、透析法及离子交换层析的原理和操作过程;
2、熟悉胰蛋白酶分离纯化的一般过程;
3、掌握胰蛋白酶活力测定方法及SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳技术。
实验原理
一、胰蛋白酶的基本特性
二、本实验采用的分离纯化方法的原理
1. 沉淀法
2. 透析法
3. 离子交换层析技术
三、胰蛋白酶活性测定原理
Lys
Val
Asp
Asp
Asp
Asp
Gly
Ile
Lys
Val
Asp
Asp
Asp
Asp
Val
His
Ser
S
S
S
S
46
183
Gly
Ile
Val
His
Ser
S
S
S
S
Enteropeptidase
肠激酶
Trypsin
胰蛋白酶
Active site
The process of trypsinogen activation
胰蛋白酶原激活过程
实验原理 二、本实验采用的分离纯化方法的原理
盐析沉淀法:用硫酸铵盐析法将目的蛋白从粗提液中沉淀出来,使其得到浓缩,并除去部分杂质(核酸、杂蛋白等)。
1. 沉淀法
实验原理 二、本实验采用的分离纯化方法的原理
由于膜两侧的溶质浓度不同,在浓度差的作用下,高分子溶液(如蛋白溶液)中的小分子溶质(如无机盐)透向透析液一侧,同时透析液中的缓冲液渗入蛋白溶液一侧,经过透析液反复换液后,即可达到脱盐和置换缓冲液的目的。
1. 透析法
实验原理 二、本实验采用的分离纯化方法的原理
同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。
蛋白质在其等电点以下(pH<pI),带正电荷,可被阳离子交换树脂所吸附;而蛋白质在其等电点以上(pH>pI),带负电荷,可被阴离子交换树脂所吸附。
本实验中的猪胰蛋白酶等电点为pI=,在pH=,可被阳离子交换树脂所吸附(本实验采用CM-纤维素离子交换树脂);而带负电荷的杂蛋白不被吸附而除去,带正电荷的杂蛋白也被吸附,但不同蛋白与树脂的吸附能力不同,通过增加缓冲液中的离子强度及提高pH,可将蛋白从树脂上洗脱下来。
在不同的离子强度下,可将不同的蛋白分别洗脱(结合力弱的蛋白最先洗脱,结合力强的蛋白最后洗脱)。
通过以上离子交换层析法,即可将目的蛋白和杂蛋白分开,从而得到纯化。
3. 离子交换层析法