文档介绍：微生物常规鉴定技术
一、形态结构和培养特性观察
1、微生物的形态结构观察主要是通过染色,在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察,直观地了解细菌在形态结构上特性,根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
2、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落(colony)。不同微生物在某种培养基中生长繁殖,所形成的菌落特征有很大差异,而同一种的细菌在一定条件下,培养特征却有一定稳定性。,以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此,微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。
1)细菌的培养特征包括以下内容:在固体培养基上,观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。
2)霉菌酵母菌的培养特征:大多数酵母菌没有丝状体,在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似,只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似,有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体,菌丝粗长,在条件适宜的培养基里,菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色,因而菌落边缘和中心,正面和背面颜色常常不同,如青霉菌:孢子青
绿色,气生菌丝无色,基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
革兰氏染色:
。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G—)两大类,是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌,是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或***脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色
步骤:
(1)涂片:涂片方法与简单染色涂片相同。
(2)晾干:与简单染色法相同。
(3)固定,与简单染色法相同
(4)结晶紫色染色:将玻片置于废液缸玻片搁架上,加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1分钟。
(5)水洗:倾去染色液,用水小心地冲洗。
(6)媒染:滴加卢哥氏碘液,媒染1min。
(7)水洗:用水洗去碘液。
(8)脱色:将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色,立即水洗。
(9)复染:滴加蕃红复染5min。
(10)水洗:用水洗去涂片上的蕃红染色液。
(11)晾干:将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。
(12)镜检:镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性。
(13)实验完毕后的处理:
①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净,。—3次。—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。
②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干
Aseptic technique:
Streak plate:
二、生理生化试验
微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物,生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。
微生物检验中常用的生化反应有:
1、尿素酶(Urease)试验
有些细菌能产生尿素酶,将尿素分解、产生2个分子的氨,使培养基变为碱性,酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶,因为不论底物尿素是否存在,细菌均能合成此酶。。
试验方法:挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中,摇均,于36±1℃培养10,60和120min,分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面,不要到达底部,留底部作变色对照。培养2,4和24h分别观察结果,如阴性应继续培养至4天,作最终判定,变为粉红色为阳性。
2、氧化酶(Oxidase)试验
氧化酶亦即细胞色素氧化酶,为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶,氧化酶先使细胞色素C氧化,然后此氧化型细胞色素C再使对苯二***氧化,产生颜色反应。
试验方法:在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴,阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色,Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。
注意事项:
(1) 盐酸二***对苯撑二***溶液