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DNA提取个步骤作用原理.doc

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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。各样质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体以外的自主复制的遗传成份,往常状况下可连续稳固地处于染色体外的游离状态,但在必定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上,跟着染色体的复制而复制,并经过细胞分裂传达到后辈。质粒已成为当前最常用的基因克隆的载体分子,重要的条件是可获取大批纯化的质粒DNA分子。当前已有很多方法可用于质粒DNA的提取,本实验采纳碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为宽泛的制备质粒DNA的方法,其基来源理为:当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够快速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状,离心时可积淀下来。纯化质粒DNA的方法往常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。比如,氯化铯-溴化乙锭梯度均衡离心、离子互换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级积淀等方法,但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇积淀等简单步骤去除剩余蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可知足细菌转变、DNA片段的分别和酶切、惯例亚克隆及探针标志等要求,故在分子生物学实验室中常用。一、Ⅰ:50mM葡萄糖,25mMTris-HCl(pH8."0),10mMEDTA(pH8."0)。1MTris-HCl<!--[if!supportAnnotations]-->[t1]<!--[endif]-->(pH8."0)12."5ml,1/80."5MEDTA()10ml,葡萄糖4."730g,加ddH2O至500ml。在10lbf/in2高压灭菌15min,储存于4℃。任何生物化学反响,第一要控制好溶液的pH,所以用适合浓度的和适合pH值的Tris-Cl溶液。50mM葡萄糖最大的利处不过悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。所以,假如溶液I中缺了葡萄糖其实对证粒的抽提自己而言,几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢?大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,配在分子生物学试剂中的主要作用是:克制DNase的活性,和克制微生物生长。在溶液I中加入高达10mM的EDTA,不过就是要把大肠杆菌细胞中的全部二价金属离子都螯合掉。假如不加EDTA,其实也没什么大不了的,只需不磨洋工,只假如在不太长的时间里达成质粒抽提,就不用怕DNA会快速被降解,因为最后溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。假如哪天你手上正好缺了溶液I,可不可以够抽提质粒呢?真话告诉你,只需用等体积的水,或LB培育基来悬浮菌体就能够了。这是用新鲜的0."4N的NaOH和2%的SDS等体积混淆后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0."4N的NaOH,不过是为了保证NaOH没有汲取空气中的CO2而减弱了碱性。好多人不知道其实破细胞的主假如碱,而不是SDS,所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最正确的溶解细胞的试剂,不论是大肠杆菌仍是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬时就溶解,这是因为细胞膜发生了从bilayer(双层膜)构造向micelle(微囊)构造的相变化所致使。用了不新鲜的0."4NNaOH,即即是有SDS也没法有效溶解大肠杆菌(不如能够自己试试看),自然就难高效率抽提获取质粒。假如只用SDS自然也能抽提获取少许质2/8粒,因为SDS也是碱性的,不过弱了点而已。好多人对NaOH的作用误认为是为了让基因组DNA变性,以便积淀,这是因为没有正确理解一些书上的相关DNA变性复性的描绘所致使。有人不由要问,既然是NaOH溶解的细胞,那为何要加SDS呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记着两点:第一,时间不可以过长,千万不要这时候去接电话,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,一定温柔混淆(象对待女孩子同样),否则基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。Ⅲ:醋酸钾(KAc)缓冲液,pH4."8。5MKAc300ml,冰醋酸57."5ml,加ddH2O至500ml。4℃保留备用。溶液III加入后就会有大批的积淀,但大多数人却不理解这积淀的实质。最简单产生的误会是,当SDS碰到酸性后发生的积淀。假如你这样思疑,往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大批积淀的出现,明显与SDS的加入相关系。假如在溶液II中不加SDS会如何呢,也会有少许的积淀,但量上要少得多,明显是盐析和酸变性积淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的积淀,那会不会是遇盐发生的积淀呢?在1%的SDS溶液中慢慢加入5N的NaCl,你会发现SDS在高盐浓度下是会产生积淀的。所以高浓度的盐致使了SDS的积淀。但假如你加入的不是NaCl而是KCl,你会发现积淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)碰到钾离子后变为了十二烷基硫酸钾(potassiumdodecylsulfate,PDS),而PDS是水不溶的,所以发生了积淀。这样看来,溶液III加入后的积淀其实是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐,使得积淀更完整。大家知道SDS特意喜爱和蛋白质联合,均匀两个氨基酸上联合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大批积淀自然就将绝大多数蛋白质积淀了,让<!--[if!supportAnnotations]-->[t3]<!--[endif]-->人快乐的是大肠杆菌的基因组DNA也一同被共积淀了。这个过程不难想象,因为基因组DNA太长了,长长的DNA自然简单被PDS给共积淀了,只管SDS其实不与DNA分子联合。3/?用无水乙醇积淀DNA,这是实验中最常用的积淀DNA的方法。乙醇的长处是能够任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反响,对DNA很安全,所以是理想的积淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳固存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA四周的水分子,使DNA失水而易于聚合。一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混淆,其乙醇的最后含量占67%左右。因此也可改用95%乙醇来代替无水乙醇(因为无水乙醇的价钱远远比95%乙醇昂贵)。可是加95%的乙醇使整体积增大,而DNA在溶液中有必定程度的溶解,因此DNA损失也增大,特别用多次乙醇积淀时,就会影响收得率。折中的做法是首次积淀DNA时可用95%乙醇取代无水乙酵,最后的积淀步骤要使用无水乙醇。也能够用0."6倍体积的异丙醇选择性积淀DNA。一般在室温下搁置15-30分钟即可。,为何必定要加NaAc或NaCl至最后浓度达0."1~0."25mol/L?在pH为8左右的溶液中,DNA分子是带负电荷的,加必定浓度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于相互聚合而形成DNA钠盐积淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA积淀不完整,当加入的盐溶液浓度太高时,其成效也不好。在积淀的DNA中,因为过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反响,%乙醇清洗积淀1-2次,4℃离心8000g×7min,弃上清,将积淀在室温下晾干。4/(含RNaseA20μg/ml),37℃水浴30min以降解RNA分子,-20℃保留备用。三、质粒DNA的电泳检测察看琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。建立目的基因的真核表达载体目的:建立目的基因的真核表达载体历时整整一学期,时期经历了好多挫折,碰到好多问题,,::这里有好多血与泪的教训。我前后一共送过九个载体测序,其中竟然有五个是引物犯错。最后一次挑的两个克隆都是上游引物犯错(此上游引物40个碱基),此后和这家引物企业交涉,他们拿走了我的板子,一次送了五个克隆测序,三个是上游引物犯错,两个是正确的克隆,60%的犯错率。此刻想一想,有几点教训:(1)尽量防止长引物的合成。越长意味着犯错的几率越大,哪家企业都这样(2)选择一家质量靠谱的企业,千万别在这省钱,引物再贵也花不了多少钱,可一轮建立下来,一测序发现引物错了,不知白扔了多少钱不说,那种心情实在是难以整理3)一旦发现引物有问题,实时换企业,我就让他们拿回去又是纯化又是从头合成过,结果仍是错,:5/8(1)扩增效率低的问题:常常taq酶扩的很好,一换成pfu就是扩不出来。解决方法:a延长延长时间(我1."2kb用3分15秒才扩出来),并适合增添循环数;b多试几家的pfu,总有一家能扩出来;c多设计几对引物试一试,总有一对能扩出来,因为pfu有外切活性,能否适合的延长引物的3’互补端;d建立中间载体:一旦用某一对引物能扩出来,把此目的片段连结t-easy中间载体,测序正确后,即能够其中间载体做pcr扩增的模板。实践证明以其中间载体为模板的pfu扩增效率远远高于以cDNA为模板。(2)pfu保真性的问题:即即是pfu,也会犯错。此刻各家企业都有号称高保真的pfu酶销售,价钱不一。"固然都是pfu,但质量不不见得同样,在都能扩增出来的状况下,选择信用好的企业的pfu。我用的是一家小企业的pfu,很廉价,100u才80块钱,但我1."2kb的片段却屡次犯错。所以万不行在酶上省那百十块钱,最后花了大钱不说,还浪费了时间精力。:在pfu摸条件这一步常常要耗资大批cDNA模板,所以在开始要准备足够的cDNA。100ul,200ul都不为过。新提取的RNA证明很好的话,就再多逆转录几管,我的RNA在-80℃放了两个月再逆转录就扩增不出目的片段了。自然这其中可能有好多原由,酶的问题,RNA的降解等等,可是当你做PCR做到很烦的时候,发现cDNA模板不够了,又从头养细胞提RNA是一件特别难过的事情。:用于建立的酶切必定要特别充分!6/8新买回来的酶要分装,用于“酶切后回收”和“酶切判定”的酶要分开。因为用于“酶切判定”时,只需能切出来就行了,而用于“酶切后回收再做连结”的酶必定要保证切的充分,才能提升连结效率,更重要的是减少挑选时的麻烦!我有一段时间连挑了三十多个克隆都是空载体,自然一方面怪我没有做载体自连的阴性比较,实时发现这一问题,另一方面酶频频从冰箱取出来活性降落酶切效率降低,致使大批的载体自己连结。我感觉内切酶这东西仍是挺娇气的,所以还是建议大家新酶分装,用于“酶切判定”的可稍放松,用于“酶切后回收”的酶必定要尽量减少冻融次数,并尽量减少在室温搁置的时间。:我设计引物时保护碱基时任意的在酶切位点双侧加上了两三个g或许c的组合,做到此后才知道加保护碱基也是有说法的,不一样的保护碱基会影响酶切的效率。以我任意加上的保护碱基,理论上酶切效率将极低。但做下来,前后酶切了四条不一样的PCR产物,我并无再这一步上碰到问题,我一般37℃切30到35个小时,酶切效率都不错。可见对于保护碱基的问题其实不是那么绝对。:再这一步上我最深刻的教训就是对于做比较的问题。第一次酶切的载体做载体自连的阴性比较,仅长出了几个克隆。为了省事,此后都省去了这一步。有两周,我连续做了两轮酶切连结挑选,总合挑了三十多个克隆,竟然全部是空载体!这时再补一个载体自连比较,满板子都是菌落。再换两支新酶从头切载体,回收后再自连,板子上仅有几个菌落。为了省一点小事费了鼎力气,懊悔莫及。此后此后,认仔细真做比较。此外,对于连结,我是用电泳的方法大体确立载体和目的片段浓度,而后1:5-8左右的比率配连结系统,感觉还不错。:有好多种方法,我主要用过两种:碱裂解粗提质粒后酶切,费时费劲,但正确性高PCR,简单省事,但易出现假阳性。7/8对比之下,我更偏向于PCR。操作过程中当心一点,尽量防止各克隆之间的污染,我还习惯于加厚厚一层白腊油,一般的我还没有碰到假阳性的状况。一个简单载体的建立,我花了整整一学期的时间。做科研的路充满了挑战,考验和艰辛。碰到问题的时候,和老师师兄师姐同学议论,到论坛上来查从前的帖子,得益匪浅。感谢论坛上的长辈们。把我的一点经验取出来和大家分享,必定也有好多不正确不完美的地方。仅供参照也欢迎议论8/8

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