文档介绍：. Total RNA Kit I (R6834-01 50 preps) 步骤
真核细胞和组织
自备材料:
β-巯基乙醇、70%乙醇(DEPC水配置)、除RNase的枪头和EP管、disposable latex gloves。
细胞的步骤
在microfuge tube中用TRK裂解缓冲液裂解细胞,使细胞团松散,轻弹EP管或者用枪头吹旋,再用漩涡振荡混匀。使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的β-巯基乙醇。
如果是单层的组织培养细胞(成纤维细胞,内皮细胞等),可以直接在细胞培养器里裂解细胞。吸净培养基后直接加TRK裂解缓冲液至细胞中。加600ul的TRK到T35细颈瓶或10cm的培养皿中,更小的培养器则加350ul的TRK。Pipette buffer over entire surface of vessel 以使裂解完全。将液体布满整个器皿表面,确保细胞裂解完全。,然后进行第2步。
如果细胞是悬液培养,收集细胞(≤1,500rpm or 400*g)*5min,弃上清,加入TRK)裂解液,漩涡振荡混匀(具体略,见说明书)。
匀浆化裂解产物
“裂解和匀浆化样品”-第四页有更详细的说明,如果细胞≤1*105,漩涡振荡1min。样品匀浆化不完全会显著的减少RNA的产量并容易造成柱子堵塞。
用匀浆器(rotor-stator )30 s,使样品匀浆化,而后进行第3步。
使裂解产物通过钝的针头的注射器(-gauge),使之匀浆化。注射器要除RNase。进行第3步。
将裂解物转移入omega homogenizer spin column,10000g离心1分钟。将flow-though移入新的tube中,进行第3步。
组织的步骤:
TRK裂解缓冲液在microfuge tube中裂解细胞,使用前每1ml TRK裂解缓冲液加入20ul的β-巯基乙醇。
350ulTRK裂解液最多能有效裂解20mg组织(-3mm3)。对20mg以上组织用600ul的TRK裂解液。然而,不要超过30mg组织,这是推荐的最大量。
对组织样品,匀浆化参照第四页,选择一种方法使用,除非是使用液氮,在TRK液/beta巯基乙醇中匀浆样品而后进行step2。
离心,>1,4000*g(maxi speed), 5min, 室温。,而后进行第3步。
总RNA分离:(pufify RNA by using HiBindTM RNA Column)
向裂解产物中加入等体积(350ul或600ul)的70%乙醇,mix thoughly by pipeting。
Apply样品到Hibind RNA Mini column上。the spin cartridge的最大容量为750ul(更大体积也能加上)。A precipitate may form on addition of ethanol in step 3。加完乙醇后可能会形成沉淀。所以要充分振荡将所有的混合液加入到柱子上。With the spin column inside a 2ml collection tube, 室温离心,10,000*g,-1min。弃去流出液(