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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。万方数据红树林混合菌群协同降解偶氮染料活性黑焉阅苎芯李亚婷欢す笄,王建宁衷视,付晓腾圩谠,,上海;匀蛔试床康趇海洋研究所海洋生物遗传资源重点实验室,福建厦门;峭反笱Ю硌г海愣峭#琖生物资源,/產⒆;。与单一菌株相比,痳摘要:通过对福建省龙海市海门岛红树林保护的近海沉积物样品进行富集驯化,得到芄恍到馀嫉H玖匣钚院幕旌暇篐籕>匝楹序列分析,鉴定该混合菌群主要由越南蔷薇菌较,混合菌群具有屁著的脱色效果,可能因其菌株之间存在着相互协同促进作用。该混合菌群对含~疞浓度的活性黑焉饔谩;旌暇篐一可以广泛利用外加碳源和氮源,如葡萄糖、***铵、牛肉膏等;浓度在7段诙伎啥曰钚院进行脱色;在臀露嫣跫峦焉首罡摺T谧钣盘跫拢没旌暇涸诙曰钚院的脱色率可达到%~%。该新型混合菌群主要通过生物降解途径来实现对活性黑耐焉āK孀沤到夥从Φ姆⑸钚院淖畲笪辗逯鸾ケ湫≈敝镣耆穑到獠镂辗逦挥诮贤夤馇关键词:混合菌群;协同降解;活性黑煌焉阅中图分类号:文献标志码:文章编号:—琇,,.,現‘,,甃,,珻:,,,瓹瑃,甌疘。.琣琤籭一收稿日期:——修回日期:接受期:作者简介:李亚婷,女,:猰篖ㄑ读O等耍豪灯淞,男,博十,研究员,研究方向::科技部年科技基础资源调查专项己牛用格式:李亚婷,付欢,肖贵谦,等红树林混合菌群协同降解偶氮染料活性黑焉阅苎芯縖生物资源,,——,,,.產琓琗琒.——瑂一現琗琫.:万方数据工业化发展使得染料需求量在印刷、化妆品、纺织、皮革和食品工业领域不断提高,染料的大量使用增加了工业废水的产生。染料的原材料构成多是化工产品,后经过人工合成而成为芳香类化合物?。大量高颜色废水被排放到河流、池塘和渠道,它通过降低光渗透率,大大降低了水生植物的光合潜力心此外,它还能通过改变值,降低溶解氧,增加生物需氧量,极大地破坏水质。由于这些芳香类化合物大多具有毒性,未经处理排放到自然环境中必然造成水体和土壤的污染,尤其是随着地表径流汇人海洋,对近岸海洋生物产生恶劣影响旧=细叩亩拘物质排放到自然环境中会持续进人食物链,进而危及人类身体健康及卫生系统。目前,利用微生物处理工业染料废水的应用和研究是前沿热点,因为污水处理中的物理化学方法缺点较多,如对一些复杂的高污泥产物不容易做吸附处理,维护成本高,对于某些化学试剂的絮凝,还会产生大量的次生污染,必须按要求进行安全倾倒处理等。由于其限制较多,所以此类方法只适合在工厂废水处理中应用,很难应用到近海岸的海洋水污染的治理之中。而生物降解是生态友好的,能够完全矿化有机化合物。生物降解是通过将大分子物质转化成为一些简单的小分子物质,最后进行彻底降解,从而减小对环境的危害。生物修复有多种优点,降解过程对环境友好,末端的降解产物无毒害。此外产生的泥量少、耗水量小,具有较高的环境经济效益,因此生物处理法更适合应用于近海岸的污水治理中。大部分降解菌株分离于土壤或污泥驯化池,多用于工业废水的处理,但很少有研究者利用生物降解法来解决近海岸海洋污染问题。近海岸为众多河流的汇集出口,往往受到河流所携带的各种污染物在人海口处沉积,造成近海岸水质下降。分离筛选来自人海口红树林区域的高效染料降解菌株,并强化菌株的脱色能力,以便于利用生物降解法来解决近海岸海洋水污染问题,能够为近海岸的海洋污染治理提供新的解决路径。本研究选取偶氮染料活性黑。。#琋。。。#喽苑肿恿课.,结构如图作为降解目标。该染料是工业中最常用的一种偶氮染料,具有牢度高、易洗涤、成本低廉等优点,在棉织物的染色和印花中使用量极大。同时该染料分子结构较为复杂,在染料废水中较难降解¨9谕舛曰钚院降解菌的研究也较多,但大多聚焦于单一菌株降解绫所示=昀囱芯糠⑾郑旌暇航系ヒ菌株具有较好的脱色降解性能。大多数纯培养的单一细菌,只能在厌氧条件下初步将偶氮染料的发色基团即氮氮双键打开,而对于产生的中间代谢产物如芳香***类化合物却很难完成进一步的降解并矿化陆6孟妇菇ǖ母春暇喝纯梢悦植股鲜不足,由于细菌混合菌群中含有大量不同的菌株,菌株之间具有良好的协同作用,可以作用于染料分子的不同结构,且多种菌株可以在厌氧与好氧两个阶段实现偶氮染料的彻底降解。因此,本课题目的在于筛选出具有高效降解染料功能的海洋来源的混合菌株,并强化菌株的脱色能力,以便于利用生物降解法来解决近海岸海洋水污染问题。牧嫌敕椒样品采集沉积物样品采集自福建省漳州市龙海市海门岛红树林保护区红树林沉积物。年赵环海门岛选择个站位,站位信息如表荆杉红树林沉积物样品,装入无菌样品杯中。活性黑到饩母患⑸秆〖***掷爰在超净台进行称重分装,取粱镅芳的锥形瓶中,再加入活性黑玖夏敢海挂禾迮嘌械幕钚院终浓度培养基:***,***,***化钾疞,磷酸二氢钾疞,磷酸氢二钠疞,葡萄糖硫酸镁需单独灭菌,冷却后混合;灭菌后补加微量元避光震荡培养,培养笥玫攘刻寤囊禾迮嘌李亚婷等:红树林混合菌群协同降解偶氮染料活性黑焉阅苎芯%一%.引言入含培养基的达到/,调至,娓哐拐羝鹁7莱恋恚咚素溶液¨初次富集的样品,放置于恒定温度℃的摇床·籺。甎,.,.簃籹籸籨—万方数据!猼《二》卜—一#琧篶一:。#琋基进行二次转接,转接比例为:。再次培养腥巫=樱钪盏玫饺巫=痈患的混合菌群。对最后一次富集驯化的混合菌群,观察降解效果。采用稀释涂布法,从富集驯化的混合菌群分离纯化菌种。将菌悬液涂布在含有料的固体桨迳希婧阄屡嘌渑嘌对分离出的菌株进行应体系包括弘福和锔耻扯0濉反应程序:℃预变姹湫嫜由个循环物工程虾股份有限公司进行测序。最终将菌株基因序列提交菘庵薪序列同源性比对,采用砑械牧诮臃ü建系统发育树不同染料浓度对混合菌群的脱色能力的/幕钚院母液,然后分别稀释配制成、、、、、黑克芤骸Mü贤夥止夤舛燃圃诨钚院的特征吸收峰分别测定不同浓度的活性黑曜既液的吸光度。以活性黑ǘ任:嶙辍⒒钚院最大吸收波长处测定的吸光度数值为纵坐标,即可得到活性黑谋曜记摺将菌种用无菌海水重悬后,按ソ又至糠直接种于含、、、、、/ǘ鹊幕钚院玖吓嘌褐校舛ň憾曰钚院的降解能力。以未接种的培养液做空白对照。将接种的培养瓶于℃摇床震荡避光培养,培养过程中取样,采用分光光度法测定混合菌群的脱色能力。脱色能力测定:取∩锨逡海捎米贤庖可见分光光度法猇琔范围内进行波长扫描,确定活性黑的最大吸收波长在度,按公式计算脱色率:—/;其中,3跏既玖吓嘌旱奈庵担珹为脱色染料培养基的吸光值,为脱色率【!混合茵群与单一菌株对活性黑耐焉将从海门岛红树林编号样品中筛选分生物资源鄄炀湫翁锤创炕敝辆湫翁恢隆扩增,性嫱嘶。锝挥缮ど的测定配制终浓度为/幕钚菌悬液样品,置于离心管中,痳胄在处。测定处吸光果分析·表粱镅氛疚恢样品编号采样站位经纬度,癓篛,癓图钚院峁..。万方数据卜一离鉴定出来的混合菌群一与其组成的单一行脱色实验测定,将菌株按サ慕又至糠直鸾又/钚院染料的培养液中,放置于摇床震荡避光培养,温度为。㈡定时对脱色液进行观察取样:通过对比法探究混合菌群与单一菌株对活性黑焉Ч牟钜欤不同培养条件下混合菌群对活性黑耐色效果分析将平板培养的混合菌群一用无菌海水温度条件为℃,。分别考察碳源为葡萄混合菌群降解活性黑淼某醪教骄紫外一可见光谱分析方法是检测染料是否被降解的基本手段“何辗逵肴玖鲜欠癖唤到庥薪裘关系,如果染料在紫外一可见光区中主要的吸收峰消活性黑玖系呐嘌褐校胖糜谝〈舱鸬幢芄馀养,温度为。㈡“峁敕治活性黑到饩纳秆⒎掷牒图十个样品经过■轮转接富集获得鲇行Ы到活性黑慕到饩海直鹞狧、一、一:其中降解效果最好的降解ǜ酶患喝⊙∈屯坎计同源性比对采用砑械牧诮法构建系统发育树,结果表明,甑ゾ直鹩胱;。笊綺“⒔I⑴菥阹能够高效降解偶氮染料活性黑系统发育树如图荆毫硗饨ň闝蛄刑峤籊数据库,得剑序列登录号分不同染料浓度下混合菌群的脱色能力染料的浓度越高,其对应的毒性越大,过高的毒菌株直鹪谙嗤呐嘌跫陆于含重悬后,以サ慕又至考尤胫林张ǘ任/的活性黑嘌褐薪型焉Ч舛ǎ撼跏寂嘌糖、蔗糖、乙酸钠和柠檬酸时该混合菌群对活性黑的脱色能力;分别考察氮源为***化铵、***铵、,琋ǘ仍~,测定不同时间培养液的脱色率。失或者产生其他新的吸收峰,则可以初步能说明染料已经被降解“。将菌株按サ慕又峙喾直鸾又钟诤。不同时间段的活性痳胄。上层离心液采用紫外可见分光光度法存菌群为板,分离纯化获得甑ゾ鶴蚎序列结果在菘饨斫行蛄异源物食烷菌裕’甌痝痆、·李弧婷等:红树林混合菌群协同降解偶氮染料活性黑焉āM幽苎芯、图钚院降解菌株序列构建的系统发育进化树疘。万方数据蛐剖孥亳穆曾粤慕善偶氮染料的降解作用”:偶氮染料活性黑旧矸子结构较为复杂,偶氮键很难断裂,是目前偶氮染料里较难以降解的一种染料。通过考察混合菌群对不由图梢钥闯觯篐籕曰钚院具有显著的脱色作用。在改良人K嘌卸/Eǘ鹊幕钚院均产生了脱色作用。稍高浓度的脱色液中生长并实现染料的降解。活性黑到饩篐籕氲ゾ焉果分析/5呐嫉H玖匣钚院可见活性黑丫唤到庵廖奚ǎ缤所示。通过紫外一可见分光光度法测定并计算得降解率达到可测得,混合菌群脱色效率远远大于单菌的脱色效率,其脱色效果如图尽S赏可知,菌株—焉Ч院茫弊罡咄焉为%左右,但单菌的脱色效率远不如混合菌群的脱色效果。因为对单一菌株而言,一般只是将发色共代谢机制,借助相互的协同作用实现偶氮染料的彻底矿化与降解、!不同培养条件下菌群一对活性黑的脱色效果分析料甚至对微生物会产生毒副作用,因此需要外源碳源和氮源通过共代谢机制实现染料的脱色或降解“。碳氮源对微生物的新陈代谢活动有重要的影生物的代谢活动,因此选择合适的碳源更有利于促进菌群对活性黑慕到狻癑。由图梢钥闯鼍痳詒同浓度活性黑哪褪苣芰Γ梢耘卸细没旌暇的应用价值及推广性。浓度为~/锻诘焉士梢源锏%~%;在浓度为~/7段峦焉在%左右。总的来说,本研究筛选到的混合菌群一具有较强的偶氮染料耐受能力,能够在混合菌群在含有染料的脱色培养基中摇床震荡培养苯庸鄄%ィ纱丝杉旌暇航到庑Ч灾=三株单菌及两两组合的细菌做脱色实验。通过实验和—曰钚院的脱色率极低,最高达到%左右;菌株◆●基团打开,对中间产物如苯***类致癌物质很难进一步降解。而混合菌群中的不同菌株会作用于染料分子的不同部分和基团,有些菌株会和其他菌株构成在微生物脱色偶氮染料过程中,以染料作为碳源和氮源往往不能满足微生物生长的需要,有些染响,可以充分被吸收利用的合适碳氮源更有利于微均可利用葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、柠檬酸四种碳源;在~保荚次U崽呛鸵宜崮剖苯生物资源·表钚院降解菌株基因序列相似度比对表最近源模式种注册号相似度/%—图混合菌群一对不同浓度耐焉阅注:分别在,,,⊥焉航胁舛图钚院降解菌群富集驯化效果图注:睿雍降解菌仞始富集效果罔;睢降解菌二次转接效果图;钚院降解菌巫=有Ч一..—遫“蓿.【::甶;%左右;菌群一在氮源为***铵,***化铵,牛肉膏鞍纂耸保簿哂薪到庑Ч素。在小体积废水模拟实验巾,菌群一在的条件下降解效果更为显著,脱色率可以达到%左右。可能因为菌株在为奶跫旅富畲τ较高的水平,因而能较好地脱色活性黑混合菌群降解活性黑幕沓醪教骄通过实验观察,在不经过离心的脱色液体系由态,可以明显看到不是菌体的吸附作用,由此瑀以初过程中所产生的代谓十产物还需进一步的研究探索。论沿海红树林积物中微生物多样性高,『】丁开发李亚婷等:红树林混合菌群协间降解偶氮染料活性黑焉阅苎芯后牛肉膏癐’说耐焉噬仙髀担赡苁因为蛋白胨能够促进减0废汆堰识塑酸脑偕铀倭伺嫉H玖系幕乖温度对细菌的生长繁殖以及酶的活性都有很大的影响。温度过低或者过高都会抑制酶的活性,所以适宜的生长温度有利于菌群对染料的降解。菌群籕婢辛己玫耐焉芰Γ涸℃下被钚院的脱色率可达%左右。染料在印染的过程中需要较高的盐度,而盐度过高会使细菌的渗透压产生变化从而影响到脱色能力。因此,,降解率比较同步,在笸焉俾始涌欤焉达到%左右。由此可以看篐籕不同盐度条件下都可以对活性黑薪到狻也是影响微生物脱色的一个重要冈素,能影响微生物细胞膜对染料分子的透过性。实际染料废水“于所含成分十分复杂,大都呈酸性或者碱性而不利于微生物生存÷根据实验数据一在谠趐范同内对活性黑的脱色效果并无很大差异,但在竺飨栽趐研究表明,微生物对染料脱色的机制有两种:生物吸附脱色和生物降解脱色。生物吸附脱色仅仅是通过染料分子与微生物表面的大分子物质相结合,从而染料被吸附到微生物表面而使废水脱色的途径”“。而生物降解脱色则是通过染料分子与微生物分泌的酶发生氧化还原反应,破坏染料大分子中的发色基团和助色基团,从而断裂成为小分子物质“:深蓝色到淡蓝色,转为淡紫色最终达到无色的状态,且最终脱色液体系经过离心后,菌体仍然为兀色状步判断是菌群的生物降解脱色。通过紫外一呵见吸收光谱扫描可知,往实验模拟废水巾活性黑目见最大吸收峰值位于处,紫外吸收峰在Γ到馇盎钚院分别对应图、澹撇它们可能是偶氮键、氨基酸等物质、随着降解反应的发生,峰逐渐降低,直至宄沟紫有代谢产物?现可能是因为一戎ɑ团的脱落,导致生色基团上电子云密度下降所致”,说明染料的结构被破坏,染料逐渐被混合菌群一降解,但其是否彻底降解活性黑敖到的功能性较多。近年来,具有石油、塑料及染料废水等污染物降解和环保价值的微乍物菌株及其基冈得到广泛的开发,展示了巨大的应用潜力:活性黑·图旌暇河氲ゾ曰钚院的脱色效果对比图ヒ痪甓訰的脱色率注:分别在取脱色液进行测定籒】、?:、,籰璉,万方数据囊一萋塞作为偶氮染料中使用最广泛且结构最复杂,最不易点。有研究发现一些降解偶氮染料的功能菌株,但年来混合菌群协同降解染料废水成为新的突破口。先前研究报道,在纺织废水污泥中分离出、,研究发现这两株细菌混合培高达.%?欢源踊钚晕勰嘌分蟹掷氲玫降复配条件下菌群的脱色效果,结果表明各复配的混降解的染料之一,也是染料废水污染中的研究重难单一菌株降解复杂污水环境的能力有限。因此,近肠球菌、肠盱捅湟炜死撞养可以高效地降解活性红玖希谕焉多株偶氮染料脱色菌进行复配实验,并探究了不同合菌群对偶氮染料的脱色能力明显要优于单一菌生物资源◆彻铺糖·蔗糖翼◆烤一鼠化铵篔犸㈠,高鴠月《·¨图煌嘌跫戮篐訰的脱色率一注:煌荚刺跫戮篐籕訰的脱色率;煌T刺跫戮篐籕訰的脱色率;煌条件下菌群对耐焉剩籨,不同条件下菌群对耐焉剩籩,不同温度条件下菌群一对耐焉剩籥,直鹪,,,,⊥焉航胁舛ǎ籧,直鹪,,,,取脱色液进行测定籋籕到馇昂蟮淖贤饪杉谱—儿籧,;琩—;琩籧图,/疞强二謦:琩籦,瑃獀甜】·万方数据株?,分析其原因可能是外在的环境因素,如碳氮源、温度和,溶氧量等,会对菌株产生促进或者抑制作用¨;或者由于内部因素,如染料的分子结构及浓度,以及不同菌株会产生不同的酶催化作用等。本研究通过在含有活性黑玖系呐嘌懈集,选择性地分离鉴定出能够高效降解活性黑混合菌群。我们分离得到的具有活性黑到庑Ч的混合菌群为一,该菌群由三株单菌构成,其中越南蔷薇菌为主要发挥降解作用的菌株,另外两株转化异源物食烷菌、近海生微泡菌自身发挥的降解作用较小,但是对主要功能菌株起到了协同促进作用,使得整体的降解效果大大增强。根据单菌脱色实验以及纯化出的单菌复配组合实验分析,纯化出的单菌经复配后的菌群并不能达到与共生状态下的混合菌群一致的脱色效果。我们推测在该混合菌群中,菌株—V饕S攀平到饩株,在共生的状态下,另外两株菌对—纳せ者某种功能酶可能起到了某种促进或者催化作用,使得该混合菌群的脱色效果达到最优。此外我们根据文献研究报道及实验分析推测,优势菌株—能具有某种偶氮还原酶,才会在另外两株菌的协同促进作用下发挥更大的自身优势。后对菌株进行全基因组测序,结果的确发现了菌株—信嫉=的协同促进下,降解能力得到了加强。另外,偶氮染料的彻底矿化降解是一个较为复杂的过程,在混合菌群的协同降解作用下,生物降解脱色则可能通过一些菌株分泌出的酶与染料物质发生氧化还原反应,从而破坏染料大分子,使其发色基团和助色基团断裂,从而变成为小分子物质,最终能等方法来检测其降解产物,进一步推测其可能降解的途径。富集菌群一通过进一步分离纯化得到基因序列分析鉴定这三株单菌分别是越南蔷薇菌、转化异源物食烷菌和近海生微泡菌。该菌群对偶氮染料活性黑哂薪细的耐受性,通过对含~进行降解实验,得出在浓度为~焉士梢源锏ァィ慌ǘ任/段谕焉试プ笥摇Mü愿没合菌群与分离出来的三株单菌进行对比降解实验发现,该混合菌群协同降解染料活性黑Ч舷灾在模拟的染料废水中诙/幕钚院脱色率高达%~%,而在同等培养条件下三株单菌和两两组合的菌株的降解率较低,可以看出该混合菌群一具有明显的降解活性黑挠势,协同降解效果远远大于单菌降解效果。通过对混合菌群一的脱色条件进行优化,发现该菌群可以利用多种碳源和氮源进行脱色;菌群在~℃均有良好的脱色能力,其中℃时脱色效果稍好;菌群一在为姆段露伎梢越型焉ǎ匝味染哂薪虾玫氖应性;该菌群在苯到庑矢谩T诖伺嘌件下可以实现对活性黑母咝焉ǎ/幕钚院脱色率高达%~%。通过紫外一可见吸收光谱扫描可以看出,随着降解反应的发生活性黑淖畲笪辗逯鸾ケ湫≈敝镣耆В说明可能是偶氮键的断裂或者是发色基团被破坏,染料逐渐被降解心“,但降解过程中产生的代谢产物及其降解途径还有待进一步研究。参考文献李亚婷等:红树林混合菌群协同降解偶氮染料活性黑焉阅苎芯解功能基因,在适宜的外在环境下以及另外两株菌否进行彻底矿化降解,后续应采用—或者—总结三株单菌,通过/ǘ鹊幕钚院/段徘旎#鹿危肓樟眨龋旌暇憾耘嫉H玖系·、鉴定与其脱色条件及机理研究暇耗暇┡┮荡笱В珻.———篔瓵#琇.—瓸琒.—,,琫:.現—,,——琧—,,.珼.,,—珻#琫..┮荡笱В甆—.冯蕾,葛苏,吴静,,宋静茹,谢学辉,,刘娜,朱少东,,,:—..—甒杨财容,杨继鸿,祁伟亮,¨阻口眩生物资源·,—,,,—甅,:.—鉴定及其特性研究肪晨蒲в爰际酰:琖.—,,琫学通报,,—痵甅张崇淼,王岱,牟霄,.:—.胡景华,朱向东,孔令保,,:—.济南:山东大学,.:。’离鉴定及复合菌群培养研究贝笱аП自然科学版:—.甁:—.—,.,,.猟!甦篔珼琄.:畉琒琙.:.:.琗:—,,.,琒琑.—!.:琎甋瓾篘纠暖—..甶琘琒珿广