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多模式超声波预处理促进克氏原螯虾酶解效果的优化.pdf

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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。:..多模式超声波预处理促进克氏原螯虾酶解效果的优化张超1,韩畅1,冯敏1,阮文燕1,杨浩泽1,徐保国邯,颜伟强3,周存山1,马海乐L2(,江苏镇江212013;,江苏镇江212013;3汇能生物科技(江苏))摘要:,对比研究了多模式超声预处理对克氏原螯虾酶解效果的促进作用。通过单因素实验得到探头式双频超声设备的最佳频率模式为20/28kHz双频顺序超声。三频发散式超声波设备的最佳频率为20/40kHz双频顺序超声。在此基础上,通过三因素三水平的响应面实验对超声预处理条件进行改进,并建立相应回归方程,优化试验以获得最佳的超声预处理条件。结果表明:双频探头式超声设备的最佳处理条件为:超声功率为250W,时间为10min,温度为35℃,%;三频超声波设备的最佳处理条件为:超声功率为250W,时间为40min,温度为40℃,%。实验结果表明多模式超声可以有效提高克氏原螯虾酶解效果。关键词:克氏原螯虾:多模式超声:水解度:响应面试验中图分类号::1673—1689(2023)10—0051—12DOl:-ModeUltrasonicPretreatmentZHANGCha01,HANChan91,FENGMinl,RUANWenyanl,YANGHaozel,XUBaoguo邯,YANWeiqian93,ZHOUCunshanl,MAHailel,2(,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China;,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China;(Jiangsu)Co.,Ltd.,Huaian223199,China)Abstract:Inordertoexploreahigh-efficientmethodtopromotetheenzymatichydrolysisofProcambarusclarkiiwithmulti—modeultrasound,thedual—frequencyprobeultrasoundandtri—frequencydivergentultrasoundwereusedtopretreatProcambarusclarkiiinthisstudy,andthepromotioneffectsofmulti—,theoptimalfrequencymodeofthedual-frequencyprobeultrasonicequipmentwasfoundtobe20/28kHzinthe收稿日期:2022—03—27修回日期:2022—04—27基金项目:江苏省政策引导类计划项目(苏北科技专项SZHZ202002)。s通信作者:徐保国(1985一),男,博士,副研究员,硕士研究生导师,主要从事食品物理加T技术及装备研究。E—mail:******@-5生物技术学报2023年第42卷第10期■置■万方数据:..£H^NL】k.』nao—eIal:upiimlza[ionoi’-nzymaucrlyorolyslsOIt-'rocamoarusC/ark//viaMulti-ModeUltrasonicPretreatmentsequentialmode,whilethatofthethree—frequencydivergentultrasonicequipmentwas20/,—frequencyprobeultrasonicequipmentweredetermined,includingtheuseof250Wultrasonicpower,treatmenttimeof10minutes,andtemperatureof35℃.Asaresult,%.Similarly,thetri—%undertheoptimalconditionsof250Wultrasonicpower,40minutesduration,and40℃.Theexperimentalresultsshowedthatmulti-:Procambarusclarkii,multi—modeultrasound,degreeofhydrolysis,responsesurfacetest克氏原螯虾是一种在淡水中生活的硬壳类动虽然超声技术在酶解过程中的应用很常见,但物[1]。20世纪20年代,日本从美国引入克氏原螯是将多模式超声波技术应用于克氏原螯虾酶解工虾,1930年前后从日本流入中国[2】。近年来,我国克艺中的研究却少有报道。作者利用不同的超声机器氏原螯虾养殖业发展迅速。据统计,在2003至2018对克氏原螯虾进行实验[151,提高酶解反应速率,减少年这十几年的时间里,,这对于增加其附加值,,尤其在2018年增幅最大,达具有积极意义。%13]。据统计,仅2018年一年,克氏原螯虾就创造了超过3500亿元的产值,同比增长了近40%【4]。克氏原螯虾作为重要的水产品,-q。克氏原螯虾:市售产品。,其频率一般在20kHz以上删,:江苏大学被大量用于食品行业,特别是在酶解等方面。超声自主研制(见图1(a));三频超声波反应设备:江苏在酶解反应中的作用主要体现在以下几个方面:底大学自主研制(见图1(b));离心机:LD5—2A,北京医物酶解前的超声预处理、边酶解边超声底物和超声用离心机厂产品。处理酶方面[10]。、浓硫酸、浓盐酸、甲解前进行预处理,不仅可以明显增加蛋白质利用醛、硼酸、***红、邻苯二甲酸氢钾、溴甲酚绿:分析率、酶的酶解率和产物的质量…],还能有效降低反应纯,国药集团上海化学试剂公司产品。时间,从而降低生产成本,提高经济效益。[12】,并非引起空化挑选饱满正常、大小适中的克氏原螯虾,用超就能形成明显的空化反应,只有保证超声的介质温声波清洗机清洗后,按照虾和水质量比为1:2加入度、机器功率、发射频率和反应时问等条件比较恰蒸馏水,然后使用多功能破壁机将原料进行破碎处当时,空化核心才能成长为能形成空化反应的气理。将虾浆液放入真空包装袋,使用不同模式的超泡,并产生有效的空化效应口31。当空化气泡坍塌时,声波机器对其进行超声处理,超声完成后加入碱性在气泡周围极小的空间内会发生物理化学相互作蛋白酶进行酶解反应。酶解的条件是:酶解时间3用和特别的物理作用,这为超声能成功的加强酶解h,加酶量2000U/g、、温度60℃;酶解反应反应奠定了基础[14]。完成后,迅速放入95℃的水浴锅中灭酶,:..张超,等:多模式超声波预处理促进克氏原螯虾酶解效果的优化DH:垒譬盟x100%(2)』V式中:DH为水解度,%;A。为克氏原螯虾离心液上清液中氨基态氮的质量浓度,g/dL;4。。为克氏原螯虾原液未水解时的游离态氨基酸质量浓度,g/dL;Ⅳ为克氏原螯虾原液中的总氮质量浓度,g/dL。,最终结果以数值的平均值和标(a)探头式双频超声设备准偏差表示,。“-影响■一一么一…:超声温度40℃、超声时间10min、超(b)二频发散式超声波设备声频率为顺序双频超声20/28kHz、超声功率依次图1多模式超声设备图为0、125、250、375、500W,-modeultrasoundequipiment虾原液进行完实验后,立即按照酶解实验要求进行min后,在5000r/min离心10min,取克氏原螯虾反应,然后测量克氏原螯虾酶解液的水解度,用水酶解液的上清液测定水解度。、时问、频率和超声温度,考察超果的影响。声预处理对克氏原螯虾酶解的影响。从图2可知。当超声的功率不断增大时,。--20100的方法对克氏原螯达到最大,这可能是由于超声波功率在一定范围内虾酶解液中的氨基酸态氮进行测定,,随着超声功率克氏原螯虾底物的酶解上清液至100mL容量瓶,的加大,超声波处理产生的空化效应也加强,显露混匀后吸取20~200mL烧杯,然后吸取60mL的蒸出原来位于蛋白质分子内部的部分,增加了和酶的馏水加入其中,用仪器搅拌混匀。,使酶促反应速率加快,从而提高了水解度。,,水解度反而减小,原醛溶液加入其中后搅匀,,会改变原NaOH溶液进行滴定,。对照实验本容易和酶结合的结构。从而导致超声功率虽然增用80mL蒸馏水。记录相关溶液的所用体积,然后大。但不能使反应的效果同步加强[16]。所以最佳的超进行计算。运算公式如下:声频率为250W。:Q:Q!垒肇些!二匕2)笪×100%(1)VV3条件设置为:超声温度40℃、超声功率250W、超声式中:4为底物所含的氨基酸态氮质量浓度,g,dL;频率为20/28kHz、超声时问依次为5、10、15、20、25y,为第二次滴定时氢氧化钠所用试样的体积,mL;rain,在此基础上将克氏原螯虾原液进行实验后,遵y:为空白对照所用试液的体积,mL;V,为将原料稀循酶解实验要求进行反应,然后测量克氏原螯虾酶释后消耗的体积,mL;V。为将原料稀释后的总体积,解液的水解度。用水解度来衡量酶解效果,考察不mL;V为所用试样的体积,mL;C为所使用的氢氧化同超声时间对酶解效果的影响。钠溶液浓度,mol/L。从图3能够发现,当时间增加时,水解度先是万方数据:..£H^Nu,unao—eIel:upumlzauon0Tr-nzymaucI-lyorolysISOIt-'rocamoarusClarkiiviaMulti-ModeUltrasonicPretreatment质与酶接触的面积,有利于蛋白酶解反应的发生。然而,随着温度的继续升高,蛋白质可以和酶接触的结构会被超声波不断破坏,因此水解度出现不断下降的现象[181,因此最佳的超声温度为35℃。,并在10min时达到最大,图4不同超声温度对水解度的影响然后水解度缓慢减小。,空化效应在短时间内会随着超声时间degreeofhydrolysis的增加而增强,。但当时问超过10min后条件设置为:超声时间为10min、超声功率为250水解度有所下降,可能是由于过长的超声时问使原W、超声温度40℃,调节超声频率分别为单频20、本能和酶接触反应的结构遭到了破坏,使酶解过程28、35kHz,顺序双频20/28、20/35、28/35kHz,同步受到阻碍[17]。所以最佳的超声时间为10min。双频20+28、20+35、28+35kHz,在此基础上将克氏原螯虾原液进行实验后,遵循酶解实验要求进行反应,然后测量克氏原螯虾酶解液的水解度,。从图5可以看出,不同的超声频率对水解度的影响不同。单频超声时,克氏原螯虾酶解液的水解度随着频率的增大而增大。其原因可能是随着超声频率的不断增大。底物中的蛋白质空间结构产生了图3不l司超声时l司对水解度的影响变化,有利于酶解反应的进行。,其原因可能是随着超声频率的增大,,影响了酶解反应的进彳亍【191。通过条件设置为:超声时间为10min、。发现不同频率之问W、超声频率20/28kHz、超声温度依次为30、35、均存在显著性差异(P<)。当超声频率为40、45、50℃,在此基础上将克氏原螯虾原液进行实20/28kHz时水解度最大,所以最佳的超声频率为验,按照酶解实验要求进行反应。然后测量克氏原20/28kHz。螯虾酶解液的水解度,用水解度来衡量酶解效果,—Beknken实验在超声实验的基础上,考察不同超声温度对酶解效果的影响。将考察因数设置为超声功率、时间和温度,水解度从图4可以看出,随着温度的上升,克氏原螯为响应值进行设计。℃时达到最数据分析和实验设计。优化探头式双频超声的实验大,其原因可能是细胞壁被超声波击破,扩大了蛋白条件,克氏原螯虾Box—Beknken实验的因素与水平万方数据:..张超,等:●2375m∞,。。皇一移专8。3j6250¨∞”99频童9/kH“z7250””,∞。125¨¨,∞"怕"375;、3所示。(水解度)与各个因素问的回面实验,确定超声波实验不同因数的最佳条件,实归方程为:<<<<”“<”/,Z,=,xdj=:..£H^Nu,unao—eIel:upumlzauonOI,-nzymaucI-lyorolysISOIt-'rocamoarusClarkiiviaMulti-ModeUltrasonicPretreatmentM=+++—+。-,因此实验的最佳条件为:超声功率由上表可知,此模型的P<,。,℃,水解度为方程极为显著:%。为了能够在实际生产中实现,,,所以不显著,因此该方程成立。参数取整,调整为:超声的功率为250W,时间为10而且超声时问、,温度为35℃.,影响程度为:%,与模型理论值相差率>时间>温度。由r2=,r2Adj=,%。证明回归方程有很高的拟合度和实用效果。模拟方案的拟合度和可信度均符合要求,所以可以所以该实验的可行性高。用于实验的理论预测。,分析超声功率、时问、温度之间的交互作条件设置为:超声温度40℃、超声时问30min、超声用。得出超声功率、时问、温度对于克氏原螯虾酶解频率为20/40kHz、超声功率依次为0、125、250、液的最佳工艺条件,结果如图6~8所示。375、500W。:..张超,等:,按照酶解实验要求进行反应,测量克氏原螯条件设置为:超声温度40℃、超声功率500W、超声虾酶解液的水解度。用水解度来衡量酶解效果,考频率为20/40kHz、超声时间依次为10、20、30、40、察不同超声功率对酶解效果的影响。50min,在此基础上将克氏原螯虾原液进行实验,按从图9可知,当功率增大时,克氏原螯虾酶解照酶解实验要求进行反应,测量克氏原螯虾酶解液液水解度先增加后减少。在超声功率为250W时水的水解度,用水解度来衡量酶解效果。考察不同超解度最高。这可能是由于当超声波功率较低时,产声时问对酶解效果的影响。生的空化作用较为缓和,显露出原来位于蛋白质分当时问增加时,克氏原螯虾酶解液的水解度先子内部的结构。更易与酶结合。但当超声功率继续是上升,然后随着时问的延长下降(见图10)。这是加大时,水解度变化趋势转变为不断下降。这是因因为随着时间的增加,超声波使蛋白质分子的结构为超声波功率过大反而会破坏了蛋白质的内部结被逐渐破坏,更多的酶结合位点被暴露出来。但是构,不利于酶解反应的进行,使水解度反而下降刚。所当超声时间过长,暴露出的结合位点也会被逐渐破以最佳的超声功率为250W。坏,所以当时问超过40min后水解度反而下降【21]。所以最佳的超声时问为40min。4240383634琴童32。302826242220图10不l司超声时l司对水解度的影响012,250j/,500功率/:超声时问30min、超声功率500W、、超声温度依次为30、35、40、45、50℃,在此基础上将克氏原螯虾原液进行实验万方数据:..£H^Nu,unao—eIel:upumlzauonOIr-nzymaucI-lyorolysISOIt-'rocamoaru5ClarkiiviaMulti-ModeUltrasonicPretreatment后,按照酶解实验要求进行反应。然后测量克氏原kHz与20+40kHz之问不存在显著性差异(P>)螯虾酶解液的水解度,考察不同超声温度对酶解效外,其余频率之间均存在显著性差异(P<)。当超果的影响。声频率为20/40kHz时水解度最大,所以最佳的超从图11可知,当温度升高时,克氏原螯虾酶解声频率为20/40kHz。液的水解度先增加后减少。在超声温度为40℃时45水解度最高。其原因可能是在超声温度较低时,,有利于酶解的进行。当超30声介质的温度继续升高时,使部分可以和酶结合的莲25Z莲25Zo20活性片段被破坏。[2q。所以超声的10最佳温度为40℃。50归她书一岛r瑰q,a绱,%嘞{%q努F10,v频4"41kH:—Beknken实验在超声实验的基础上,将考察因数设置为超声功率、时问和温度,,优化三频超声波的实验条件,图11不l司超声温度对水解度的影响Effectofdifferentultrasonicon克氏原螯虾Box—。:超声温度40℃、超声功率500W、超声Procambarusclarkii时问为30min,调节超声频率为单频20、40、60kHz,顺序20/40、20/60、40/60、20/40/60kHz,同步20+40、20+60、40+60、20+40+60kHz,在此基础上将克氏原螯虾原液进行实验后。遵循酶解实验要求进行反应,然后测量克氏原螯虾酶解液的水解度,用一11253025水解度来衡量酶解效果,考察不同超声频率对酶解02504040效果的影响。13755045从图11可以看出,不同的超声频率对水解度的影响不同。单频超声时,,其原因是经超声预处面实验,确定超声波实验不同因数的最佳条件,实理后。蛋白质的结构分布发生了变化,有利于与酶验结果如表5~6所示。作用。顺序双频与同步双频超声时,水解度随着频根据表5中所输人的实验数据可以由Design率的增大反而减小,其原因可能是随着超声频率的expert11软件得出M(水解度)与各个因素间的回增大,原本易与酶作用的蛋白质分子结构发生了改归方程为:[231。=-+++++软件进行显著性分析,发现除20kHz与40+60、—-:..张超,等:多模式超声波预处理促进克氏原螯虾酶解效果的优化表5优化实验方案与结果由表3可知。,所以Table5Optimizationexperimentalschemeandresults该模型方程极为显著;,,所以不显著,。且时间、,所●,影响程度为:>时间>温度。由r2=,r2M=,。,分析超声功率、时问、,得出超声功率、时问、。结果如图13~15所示。,,因此实验的最佳条件为:超声功率m¨,。℃,%。为了能够在实际生产中实现,,调整