文档介绍：重要定义 1
转换光密度单位的方法如下 1
AOI技巧(灰度值、面积测量) 2
编制宏 4
计数 8
图象分析策略 11
图片的保存 13
光密度 13
关闭相机的自动白平衡功能 15
免疫组化光密度测量 16
统计问题 21
宏操作 22
转换光密度单位→选好待测量的区域→指定测量项目→进行测量统计
重要定义:
①把图片中呈现黄色的区域给挑选出来,这部分区域是我们最感兴趣的地方,叫作AOI(area of interest)
②图片中被标上红色的区域被定义为一个class,其中每一个独立的小区块被定义为这个class中的一个object。以此图为例,图中深蓝色的部分是细胞核,因此所有的细胞核都被选中成一个class,其中每一个细胞核就是一个object
③在默认的intensity格式中,是图片灰度,越黑数值越小,越白数值越大。而实际上我们测量的染色强度是光密度,染色越深,光密度值越大。需要进行转换图象intensity格式,如果不进行光密度单位的转换,测量的数值将完全是错误的。
转换光密度单位的方法如下:
点击:measure--carliberation--intensity,调出intensity校正窗口。
然后在窗口中点new按纽,再点一下下面的std optical density选项,这时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线。
然后还要点一下最上面的system按纽。最后点close关闭窗口。
这样就把程序系统的灰度单位转换成了光密度单位。
将光密度单位设定为system之后就不必再对后面的每一张照片都进行光密度校正了。
AOI技巧(灰度值、面积测量):
(1)segmentation工具:面对组织切片中密密麻麻的细胞,就得用本主题讨论的segmentation工具。
正确的操作顺序是:先打开select measurement,选择好各个测量项目,再回到count/size中点select color进行颜色选取,再回到count/size窗口中点count计数。这样操作结束后仔细观察一下计算的区域,正是刚才正确选取的区域了。
①点measure的select measurement ,选中area, density(mean),IOD。
②选manual,并点select color调出segmentation窗口。窗口里有两个表单,一个是color cube based,另一个是histogram based。我们要选取后者,并且使用HSI颜色格式来进行分色选择。当切换到HSI时,会弹出一个窗口提示你会reset颜色选择,是否继续?当然是OK啦。这时的颜色选择全部重置为0-255。在HSI颜色格式中,H为色调,就是我们眼睛所看到的红橙黄绿青蓝紫等。S为色饱和度,I为强度。在选择AOI时,首先保持S、I为最大范围,从H中选择黄色部分。点一下H,直方图显示就是图片各象素H值的分布,在直方图的两边各有一根线,这就是选择线,先将右边的线用鼠标左键向里面拉,拉一点停一下看看效果,可以看到最开始时是选中了全部画面,然后是蓝色的区域慢慢显露出来,并且越显越多,选择线的位置也在下面的窗口中有显示,是0-255之间的数,共有两个窗口,左边是取值下限,右边是取值上限,先不断减小上限值使得非黄色区域不断地显露出来,再不断增加下限值让另一部分非黄色的区域也显露出来。
这张照片中黄色区域为H:0-33。色饱和度S与强度I都直接设为0-255。这就是说,只要是黄色,就被认为是阳性表达的区域。
过滤(去除杂质小点):
上面选取的区域还是有一点不准确。图片中被选中的区域有许多很小的选点,显然这是各种杂质,并不是成片的蛋白表达区域。对这些杂质小点有一个有效的方法来去除,就是测量过滤(filter)。
打开select measurement窗口,点一下中间被选中测量项目中的area项,使其加亮。这时下面的start与end选项就变黑可调了。对area来说,默认值一般是0,意思是不管区域有多小,都被计入测量范围内。现在我们把它改为50,也就是说,忽略了象素点小于50的杂质点,不予计算在内。改完后点一下旁边的Filter按纽,再点measure按纽,或者回到count/size窗口内把Apply Filter Ranges in Range前面的选项给勾上,再点count按纽,这回就把小杂质点全给过滤掉了。
③回到count/size窗口,按count纽。
凡是玩电脑都必会有一个reset键。不管作错了什么事,按一下reset键就可以全部重新来。选AOI也是这样,如果选得不合心意,想全部重新来的话,按count/size窗口中的delete键,就可以把刚才作的一切都给全部推