文档介绍：根癌农杆菌介导的植物基因遗传转化技术
常用的植物基因转化技术
农杆菌介导法
植物病毒载体介导法(如CaMV)
DNA直接导入法(PEG介导法、脂质体法、基因枪法、电激法、激光微束法、显微注射法等)
种质系统介导基因转化(花粉管通道法等)
其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐
若干主要的植物细胞转化方法的比较
评价内容
植物转化方法
农杆菌法
PEG法
电击法
微注射法
基因枪法
花粉管通道法
受体材料
外植体
原生质体
悬浮细胞
细胞或组织
外植体
卵细胞
宿主限制
有
无
无
无
无
开花植物
培养条件
简单
复杂
复杂
复杂
简单
无
转化频率
10-2~10-1
10-5~10-4
10-5~10-4
10-2~10-1
10-3~10-2
10-1~101
嵌合体
有
无
无
无或有
多
无
操作
简单
简单
复杂
更复杂
复杂
简单
设备要求
便宜
便宜
昂贵
昂贵
昂贵
简便
工作效率
高
低
低
更低
高
低
若干主要的植物细胞转化方法的比较
方法
优点
缺点
农杆菌介导法
转化效率高
主要以单拷贝或低拷贝形式插入
不需要特殊的专用设备
只能以T-DNA插入的方式导入寄主细胞
化学法及电激法
操作简单
转化效率高
同一实验可处理许多样品
化学法不需要特殊的专用设备
外源DNA重排率高,常为多拷贝形式插入
化学法需通过原生质体培养及其再生体系,才能产生
有体细胞克隆变异的风险
基因枪法
不受物种界限的约束
可用于不同的转化样品,如根、茎、叶、愈伤等
需复杂的专用设备
外源DNA重排率高,常为多拷贝形式插入
显微注射法
不受物种界限的约束
可用于不同的转化样品,如根、茎、叶、愈伤等
需昂贵的专用设备
需接受专门训练的技术人员进行操作
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
在植物基因工程的发展中, 研究最清楚和应用最成功的是根癌农杆菌介导的遗传转化, 在已获得的近200种转基因植物中约80%是由该菌介导完成的. 起初, 人们认为农杆菌仅能转化双子叶植物、裸子植物以及少数几种单子叶植物;而近几年, 由于在一些重要的单子叶植物以及在真菌中应用农杆菌转化获得了成功,该方法以转基因低拷贝、遗传稳定以及能够转化大片段DNA等优点又受到了人们极大的关注.
Ti质粒
Ti质粒(tumor-inducing plasmid):Ti 质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质,为双链共价闭合的环状DNA分子。Ti质粒中有一段DNA,称为T-DNA(transfer-DNA),能转移并整合到植物基因组中,并导致冠瘿瘤的形成
Ti 质粒可分为4 个功能区域:
①T-DNA区:T-DNA是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA,含有编码植物激素和冠瘿碱的基因;
②Vir 区:Vir 区上的基因能激活T-DNA 转移,使根癌农杆菌表现出毒性;
③Con 区(接合转移编码区):该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因,调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移;
④Ori区(复制起始区):Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。
Ti质粒介导转化的过程
农杆菌吸附于植物的表面伤口部位
受酚类物质(乙酰丁香酮或羟基乙酰丁香酮)的诱导,vir区基因被激活,virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB序列切出单链切口,释放出T-DNA的单链线性拷贝(T-链)
T-链在RB序列的引导下定向穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中
T-DNA在植物细胞中表达