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行X射线衍射图谱测定得到的,即碱基对与螺旋轴垂直,每个碱基对围绕相邻的碱基对旋转36°,因此一个螺旋含有十个碱基对,。螺旋外部的两个“沟”,一个宽而深,称为“大沟”,为DNA与DNA和DNA与蛋白质的相互作用提供了环境;一个窄而浅,称为“小沟”,为一些小分子和DNA相互作用提供了环境。A-DNA是在相对湿度为65%-75%的条件下形成的,每圈有11个碱基对,碱基对的平面与螺旋轴成30°。B-DNA和A-DNA在一定条件下可以相互转换,如在转录过程中,DNA模板被RNA聚合酶结合合成RNA时,DNA可能变成A型。C-DNA是以Li+作为反离子,当相对湿度降到66%时就会出现。C-DNA呈左手螺旋,,目前这一构象仅在实验室中观察到,在生物体内并未有证据证明它的存在。Z-DNA为左手双螺旋,每圈螺旋有12个碱基对,,比B-DNA更细长。现有研究表明Z-DNA参与基因调节和控制基因的开关。因为Z-DNA的形成,使局部DNA双链处于不稳定状态有利于双链解开,而DNA解链是DNA复制和转录的必要环节。DNA的二级结构具有多态性,:..但B-DNA是生物体内最常见、最稳定的构象,由于DNA一直处于动态的过程中,所以才会有其他构象的出现。。三链DNA是在DNA双螺旋的基础上形成的三链区的3条链均为同源嘌呤(HPu)或同源嘧啶(HPy),即整段的碱基均为嘌呤或者嘧啶。根据第三条链的来源,三链DNA可分为分子间和分子内两组;根据三条链的组成以及相对位置又可分为Pu-Pu-Py和Py-Pu-Py两种类型。最常见的为Py-Pu-Py型,它的三条链中有两条链为正常的双螺旋,第三条嘧啶链位于双螺旋的大沟中T与嘌呤链的方向一致T并随双螺旋结构一起旋转。碱基的配对方式不变,但第三条链上的C必须质子化,且与G形成两个氢键。四链体DNA也是非经典的碱基配对方式,主要有G-quadruplex和i-motif两类。G-quadruplex是在G-四联体的中心有一个有四个带负电荷的氧原子围城的口袋,通过G-四联体的堆积可以形成分子内或分子间的右手螺旋。i-motif的形成原理为:胞嘧啶C在酸性环境下可以被质子化为C+,与C形成三氢键的配对。富含C的寡核苷酸片段部分质子化后,通过C·C+配对成平行的双链结构,然后双链反向排列,碱基对之间相互交错,从而形成四链结构。二、DNA测序技术的发展与测序仪设计DNA测序技术是分子生物学相关领域研究中常用的技术方法之一。迄今为止已经发展到了第三代测序技术。每一代测序技术的更迭都是技术领域的重大突破,既降低了测序的成本,又提高了测序的速度,使测序技术可以更加广泛的应用于各个领域。伴随着测序技术的不断发展,各种类型的测序仪也是争相涌现,为测序技术的进步提供了条件。。SBC法是1977年美国哈佛大学的Maxam和Gilbert发明的,因此也称为Maxam-Gilbertmethod。该方法是利用化学降解法来进行DNA测序。方法是将5′端被标记的目的DNA分子分别进行5个各自独立的反应,分别用不同的化学试剂将目的DNA分子部分打碎成重复的单个碱基片段,然后进行聚丙烯酰***凝胶电泳分离,再经过放射线自显影,根据不同泳道所显示的条带情况,从而可以获得目的DNA分子的碱基序列。SBS法是1997:..年由Sanger发明的,其原理是利用双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)的结构比脱氧核苷三磷酸(dNTP)缺少了3’-OH,因此可以使得DNA链的合成中断这个性质来设计四个相互独立的反应。在每个反应中都分别加入四种dNTP和不同的ddNTP,并用同位素进行标记。由于加入的ddNTP的量占得比例很小,因此最后会合成出不同长度的DNA链。最后利用聚丙烯酰***凝胶电泳分离得到DNA分子的碱基序列。由于SBS法比SBC法具有更多的优点,例如所用试剂无毒、操作简单、结果稳定、所需设备简单等等,SBS法广为使用。上世纪80年代末期,荧光标记技术凭借更加安全的特性逐渐取代同位素标记技术。1986年,LeroyHood发明了四色荧光物质,不同波长的激光可激发其产生不同的颜色。用这些荧光物质来标记四种不同的ddNTP,可以实现一条电泳道测定所有的反应产物,使用对应的激光器可以对胶板上的通过的测序反应产物进行扫描。测序的效率被提高了很多,分辨率也大为提高。根据上述原理,美国ABI公司推出了第一台商品化的测序仪——ABI370A,但此阶段的测序仪并没有实现完全的自动化,其中的制胶和加样还是需要人工来完成。随着基因组学的发展对测序技术的要求,后来的毛细管电泳技术相比平板电泳技术实现了更加规模化、高通量、低成本的特点。此时期ABI公司开发的377型、373型测序仪采用了毛细管电泳技术,可以实现电泳过程自动化、并行化,灵敏度高、所需样品少,且快速高效。,它突破了第一代测序技术效率的瓶颈问题,实现了真正意义上的高通量测序,是测序技术发展史上影响最为深远的一场革命。目前第二代测序的主要技术平台包括Roche/454GSFLX、Illumina/SolexaGenomeAnalyzer、HelicosBioSciences公司的HeliScope?SingleMoleculeSequencer、美国DanaherMotion公司推出的Polonator;以及连接法测序(sequencingbyligation),即通过引物来定位核酸信息,技术平台有AppliedBiosystems/SOLiD?system。以上技术平台所运用的测序原理均为循环微阵列法。以Illumina测序仪所使用的克隆单分子阵列技术为例来讲一下该类型的测序仪的设计原理。将目的DNA分子打断成100~200bp的片段,随机连接到固相基质上,经过Bst聚合酶延伸和甲酸***变性的桥PCR循环,生成大量的DNA簇,每个DNA簇中约有1000个相同序列的DN***段。之后的反应与Sanger法类似,加入:..用4种不同荧光标记并结合了可逆终止剂的dNTP。固相基质上每个孔有八道独立检测的位点,所以一次可以并行八个独立文库,可容纳数百万的模版克隆,可把多个样品混合在一起检测,每个固相基质上一次可读取10亿个碱基。DNA簇与单链扩增产物的通用序列杂交,由于终止剂的作用,DNA聚合酶每次循环只延伸一个dNTP。每次延伸所产生的光信号被标准的微阵列光学检测系统分析测序,下一次循环中把终止剂和荧光标记基团裂解掉,然后继续延伸dNTP,实现了边合成边测序技术。,但是仍然它仍然存在一些固有的问题,如成本、结果误差等,随着科学技术的进一步发展,出现了第三代测序技术。其中包括单分子读取技术和纳米孔单分子测序技术,它们都不需要PCR扩增,具有很好的应用前景。PacBio测序仪的基本原理是单分子实时测序技术(SMRT),可以实现DNA***化的直接测序。纳米孔测序的基本原理是当单链DNA分子穿过生物分子组成的纳米级小孔时,由于不同的碱基的形状大小有差异,与孔内的环式糊精分子发生特异性反应,引起电阻变化。只要在纳米孔的两侧加上一个恒定电压就可以检测到纳米孔的电流变化,从而反映出通过小孔的单链DNA分子的碱基排序情况。该技术的主要问题暴扣纳米孔的精度、双链DNA穿过纳米孔的速度问题。参考文献:[J].生物学杂志,1999,(04):8-,张映,——DNA结构的多态性[J].生物学通报,2004,(09):22-[D].武汉大学,,赵明,胡志迪,,35:811-,2012,47:14-,-,1980,65:499-,1,38-69;doi:.:..,吴思佳,刘瑞玲,吕红强,[J].生命科学仪器,2017,(01):43-45+42.