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其他设备和材料如下:、恒温培养箱:36℃±1℃,30℃±1℃。、冰箱:2℃~5℃。、恒温水浴箱:46℃±1℃。、天平:。、均质器。、无菌吸管:1mL()、10mL()或微量移液器及吸头。、无菌锥形瓶:容量250mL、500mL。、无菌培养皿:直径90mm。、PH计或pH比色管或精密pH试纸。、放大镜或/和菌落计数器。3、、平板计数琼脂培养基:、成分:;;;;蒸馏水1000mL;±。:将上述成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH,分装试管或锥形瓶,121℃高压灭菌15min。、、成分:磷酸二氢钾(KH2PO4);蒸馏水500mL;。、制法:贮存液:,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。2稀释液:,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121℃高压灭菌15min。、、成分:***;、制法“***化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。4、检验程序:5、、、称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1:10的样品匀液。、用1mL无菌吸管或微量移液器吸取 1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。、,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1mL无菌吸管或吸头。、根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释时,吸取1mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。、及时将15mL~20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。、、待琼脂凝固后,将平板翻转,36℃±1℃培养48h±2h。水产品30℃±1℃培养72h±3h。、如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4mL),凝固后翻转平板,。、菌落计数:可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。、选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。、其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。、当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。6、、菌落总数的计算方法。、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)样品中菌落总数结果。、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按公式(1)计算:式中:N——样品中菌落数;ΣC——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d——稀释因子(第一稀释度)。、若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。、若所有稀释度的平板菌落数均小于 30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。、若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。、若所有稀释度的平板菌落数均不在 30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。、菌落数小于100CFU时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。、菌落数大于或等于100CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。、若所有平板上为蔓延菌落而无法计数, 则报告菌落蔓延。、若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。、称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。7、报告稀释度1:1001:10001:10000CFU/g平均值第一个样品第二个样品六、-2010大肠菌群MPN计数法1、原理:在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。最可能数,MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。2、设备和材料:除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下:、恒温培养箱:36℃±1℃。、冰箱:2℃~5℃。、恒温水浴箱:46℃±1℃。、天平:。、均质器。、无菌吸管:1mL()、10mL()或微量移液器及吸头。、无菌锥形瓶:容量500mL。、pH计或pH比色管或精密pH试纸。3、、、;***;;磷酸氢二钾(K2HPO4);磷酸二氢钾(K2HPO4);;蒸馏水1000mL;±;、制法:将上述成分溶解于蒸馏水中,调节pH,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。、煌绿乳糖胆盐肉汤“、成分:;;牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液200mL;%;蒸馏水800mL;±;、制法:将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(,~),用蒸馏水稀释到975mL,调节pH,%,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。、磷酸盐缓冲液:、成分:磷酸二氢钾(K2HPO4);蒸馏水500mL;。、制法:贮存液:,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液:,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121℃高压灭菌15min。、无菌生理盐水:***化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。、无菌1mol/LNaOH:称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。、无菌1mol/LHCl:移取浓盐酸90mL,用蒸馏水稀释至1000mL,121℃高压灭菌15min。64、检验程序:5、、、称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1:10的样品匀液。、~,必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。、用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。、根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。、初发酵试验:7每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤),36℃±1℃培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。、复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物 1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤BGLB)管中,36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。、大肠菌群最可能数(MPN),检索MPN表,报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。报告稀释度 1:100 1:1000 1:10000 CFU/g 平均值第一个样品第二个样品8七、感官检验 GB/-20031、组织形态、色泽、气味将抽取的微生物检验试验后的全部样品,置于自然光或相当于自然光的感官。评定时,用触觉鉴别组织形态,视觉鉴别色泽,嗅觉鉴别气味。2、煮沸后肉汤的检查称取20g绞碎的试样,置于200mL烧杯中,加入100mL水,用表面皿盖上加热50℃~60℃,开盖检查气味,继续加热煮沸20min~30min,检查肉汤的气味,滋味和透明度,以及脂肪的气味和滋味,并参见卫生标准。3、肉眼可见异物:用视觉鉴别,与鉴别组织状态、色泽、气味同时进行。4、报告项目 鲜产品 冻产品组织状态色泽气味加热后肉汤淤血[以淤血面积(S)计]/cm2硬杆毛(长度超过 12mm的羽毛,或直径超过2mm的羽毛根)异物注:,或单一分割肉禽的一片淤血面积。八、挥发性盐基氮(半微量定氮法)GB/-20031、原理:挥发性盐基氮是指动物性食品由于酶和细菌的作用。在***过程中,使蛋白质分解而产生氮以及***类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性,在碱性溶液中蒸出来后,用标准酸溶液滴定计算含量。2、试剂:、氧化镁混悬液(10g/L):,加100mL水,振摇成混悬液。、硼酸吸收液(20g/L)。、盐酸[c(HCl)=]或硫酸[c(1/2H2SO4)=]的标准滴定溶液。、***红-乙醇指示剂(2g/L)。、次***蓝指示剂(1g/L)。临用时将上述两种指示液等量混合为指示液。3、仪器:、半微量定氮器。、微量滴定管:。4、分析步骤:、试样处理:将试样除去脂肪、骨及腱后,绞碎搅匀,,置于锥形9瓶中,加100mL水,不时振摇,浸渍30min后过滤,滤液置冰箱备用。、蒸馏滴定:将盛有10mL吸收液及5滴~6滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端,并使其下端插入吸收液的液面下,,加5mL氧化镁混悬液(10g/L),迅速盖塞,并加水以防漏气,通入蒸汽,进行蒸馏,蒸馏5min即停止,吸收液用盐酸标准溶液()或硫酸标准滴定溶液滴定,终点至紫色。同时做试剂空白试验。5、结果结算:试样中挥发性盐基氮的含量按式( 2)进行计算。V1-V2)×c×14X= ————————×100 (2)m ×5/100式中:X--试样中挥发性盐基氮的含量,单位为毫克每百克( mg/100g);V1--滴定用样液消耗盐酸或硫酸标准溶液体积,单位为毫升( Ml);V2--试剂空白消耗盐酸或硫酸标准溶液体积,单位为毫升( Ml);C--盐酸或硫酸标准溶液的实际浓度,单位为摩尔每升( mol/L);14--[c(HCl)=] 或硫酸标准滴定溶液[c(1/2H2SO4)=]相当的氮的质量,单位为毫克(mg);m--试剂质量,单位为克(g)。计算结果保留三位有效数字。6、精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。7、实验记录:V1 V2 C X 平均值第一个样品第二个样品九、总***的测定 GB/-2003 二硫腙法1、原理:样品经消化后,***离子在酸性溶液中可与双硫腙生成橙色络合物,溶于三***佐烷,与标准系列比较定量。2、试剂与仪器:、***。、硫酸。、氨水。、三***甲烷:不应含有氧化物。、硫酸(1+35):量取5m1硫酸、缓缓倒入l5Oml水中,冷却后加水至180ml。10