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一种对乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法及应用的制作方法.docx

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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种对乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法及应用的制作方法一种对乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法及应用的制作方法本发明公开了一种对乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法及应用,步骤为:将新鲜的肝组织经暴露的血管用灌注溶液冲洗干净,直至消化完全;然后将新鲜分离的肝细胞置于含有细胞洗液的培养皿中过细胞筛得到单细胞悬液;清洗后沉淀单细胞并重悬,用渐进冻存的方法,保存于液氮;复苏的胎肝细胞通过优化高活力胎肝细胞的铺板密度、Percoll离心介质纯化低活力胎肝细胞以及后续培养程序,建立紧密的细胞单层培养。本发明可大量分离、保存及高效率复苏胎肝细胞,复苏的胎肝细胞能保持良好的肝细胞特性、分化状态及对乙型肝炎病毒易感性,从而缓解原代肝细胞资源稀缺问题,并建立了稳定的体外抗乙型肝炎病毒筛药平台。【专利说明】一种对乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法及应用【技术领域】[0001]本发明涉及医药生物【技术领域】,具体涉及一种对乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法及应用,该方法可大量分离、冻存与复苏人胎肝细胞,复苏后的胎肝细胞保持良好的肝细胞功能以及对乙型肝炎病毒易感性。【背景技术】[0002]人原代肝细胞(英文缩写为PHHs)目前被认为是最理想的体外肝特异性病理研究的细胞模型,例如,运用这种细胞可建立对乙型肝炎病毒(英文缩写为HBV)的体外感染。PHHs也被公认为是一种很有价值的肝细胞移植的细胞来源,为肝功能衰竭患者带来了重生的希望。然而,新鲜肝组织资源稀缺,肝细胞数量有限,批次间肝细胞差异等问题,极大地限制了其大规模应用。细胞冻存被认为是一个很有前途的解决方案。目前,关于原代***肝细胞的冻存和复苏方法的工作已经有很多文献报道,但迄今报道的复苏效率相对较低且不稳定。另一个PHHs重要来源是人胎肝细胞(英文缩写为HFHs),它是人成熟肝细胞的早期阶段,具有相对较高的细胞活力和增殖能力,这些特性赋予它们即使在恶劣的冻存过程后仍然可以被复苏并形成致密单层细胞的潜力。此外,原代***肝细胞通常分离自肝病患者的病变肝活检组织,细胞数目少且细胞活力低;而HFHs通常分离于已死胎儿的新鲜肝组织,可以提供更大量的高活力肝细胞。目前为止,还没有如何冻存和复苏HFHs的研究报告及专利。[0003]乙型肝炎病毒(英文缩写为HBV)感染及其相关疾病是中国的重大疾病之一,,每年死于相关疾病的病人约一百万。由于长期缺乏支持完整HBV感染与复制的药物筛选与评价平台,HBV的治疗策略与方法相对滞后。人原代肝细胞是HBV研究最为理想的细胞感染模型,能够支持HBV完整的感染与复制循环,能够在体外最为真实地反映药效及药代动力学。由于上述PHHs局限性问题使得实验很难大规模进行,实验重复性差。本专利利用优化的冻存与复苏条件,证明冻存复苏后的HFHs仍然具有HBV易感性,在很大程度上解决了上述PHHs局限性。[0004]大量的研究表明,原代肝细胞移植对肝功能衰竭病人的治疗效果卓著,可以极大缓解病人对供肝的需求,是一种很有应用前景的治疗策略。肝细胞的数量及质量决定了该治疗策略的可行性。本专利利用优化的冻存与复苏条件,可以大量冻存HFHs,复苏后的HFHs具有良好的细胞活力及肝细胞功能,具有极大的临床应用前景。【发明内容】[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种对乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法,包括:利用两步胶原酶灌注法,从已死胎儿新鲜肝组织中分离得到大量的高活力胎肝细胞,经过渐进冷冻的方法长期低温保存原代胎肝细胞,再通过优化复苏条件,Percoll离心介质纯化低活力胎肝细胞以及后续培养程序,建立的单层细胞保持良好的原代胎肝细胞形态特征、肝细胞特异的蛋白表达、良好的细胞增殖活力以及对乙型肝炎病毒的易感性。[0006]本发明的另一个目的在于提供了一种乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法在构建抗HBV入侵药物筛选与评价的体外细胞模型中的应用。[0007]为解决上述技术问题,本发明采取以下技术措施:[0008]一种人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法,包括以下步骤:[0009]I)已死胎儿新鲜肝组织经暴露的血管用灌注溶液I灌注,直至肝组织中血液被冲洗干净;[0010]2)用37°C预热的灌注溶液II灌注步骤I)中冲洗干净的肝组织,直至肝组织失去弹性消化完全;[0011]3)将步骤2)消化完全的肝组织转移至含有细胞洗液的培养皿中,抖落消化好的细胞,形成细胞悬液;[0012]4)将步骤3)中细胞悬液通过70μm的细胞筛,得到单细胞悬液;[0013]5)将步骤4)获得的单细胞悬液在800转/分钟和4°C条件下,离心5分钟沉降,用细胞洗液重悬,重复离心二次;[0014]6)利用台酚蓝染色法计算步骤5)中重悬细胞的细胞密度与细胞活力,细胞活力为60%~95%时冻存;[0015]7)将步骤6)中单细胞`悬液重复离心一次,细胞沉淀利用细胞冻存液以IO7个活细胞/ml的密度重悬细胞。将重悬的细胞以I支冻存管I毫升的量分装细胞悬液,再将冻存管转移到冻存盒(M,降温速度为每I分钟1°C),盛有细胞的细胞冻存盒放于-80°C冰箱10-14小时,经过该渐进冷冻后,冻存管转移到液氮罐中长期保存,最长保存记录为24个月;[0016]8)取出需要复苏的细胞,置于37~40°C的水浴锅中I~2分钟,800转/分钟离心3分钟,去掉细胞冻存液,利用铺板培养液重悬细胞,台酚蓝染色法计算重悬细胞的细胞密度与细胞活力;[0017]9)将获得的肝细胞且细胞活力大于70%以3~4XIO5活细胞/cm2的密度接种到胶原包被的培养皿或培养板中,摇匀后培养4~6小时将培养液换成生长培养液,培养24小时后,再将生长培养液换成维持培养液;[0018]10)步骤8)中细胞活力为40%~70%时,复苏胎肝细胞用PBS洗2次,利用密度梯度为70%、50%、30%的Percoll离心介质纯化得到高活力胎肝细胞,离心条件为350Xg,4°C离心30分钟;取Percoll密度70%与Percoll密度50%之间的细胞层,PBS清洗2次,台酚蓝染色法计算重悬细胞的细胞密度与细胞活力,后续铺板与培养过程同步骤9)。[0019]所述灌注溶液I配方为:***化钠、***化钾、、、、lg/L葡萄糖、ImM***酸钠和2mM乙二醇双(2-氨基***)四乙酸,;[0020]所述灌注溶液II配方为:***化钠、***化钾、、、、lg/L葡萄糖、ImM***酸钠、5mM***,;[0021]所述细胞洗液的配方为:DMEM培养液使用前加入10%v/v胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素;[0022]所述细胞冻存液为=William氏E培养基使用前加入45%v/v胎牛血清和10%v/v二甲亚砜(英文缩写为DMSO)。[0023]所述铺板培养液的配方为=William氏E培养基使用前加入IOmM尼克酰***、20mM轻乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L***酸钠、-2-磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰***、KT7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和5%v/v胎牛血清;其中,ITS+、、、/ml亚油酸;[0024]所述生长培养液的配方为=William氏E培养基使用前加入IOmM尼克酰***、20mM轻乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L***酸钠、、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰***、I(T7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和20ng/ml表皮生长因子;其中,ITS+、、、/ml亚油酸;[0025]所述维持培养液的配方为=William氏E培养基使用前加入IOmM尼克酰***、20mM轻乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L***酸钠、、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰***、KT7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和2%v/VDMSO;其中,ITS+、、、/ml亚油酸。[0026]作为优选方案,所述步骤6)或8)中,确定细胞密度与细胞活力的方法为:%m/v台酚蓝染色液以1:1的体积比混匀,迅速将20uI混合液加入到计数板中且将该计数板插入相应的计数仪中,仪器读出相应的细胞密度与细胞活力,%台酚蓝染色液具体配制方法为:(英文缩写为PBS)中,具体配方为:***化钠、***化钾、/L磷酸二氢钾,,高压蒸汽灭菌,4°C保存备用。`[0027]作为优选方案,所述胶原包被的培养皿或培养板的制备方法:将172ill冰醋酸加入到100ml去离子水中,再加入终浓度为50iig/ml的IV型鼠尾胶原,在无菌条件下,,4°C保存待用;将该工作液以5ug/cm2的包被量加入到需要包被处理的培养板或培养皿中,常温孵育;1小时后,将胶原工作液吸出,自然晾干后封口4°C保存;使用前,将胶原包被的培养皿或培养板需用PBS清洗一次,以去除残留的醋酸。[0028]一种乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法在构建抗HBV入侵药物筛选与评价的体外细胞模型中的应用,其应用过程如下:[0029]I)培养的细胞在铺板后6天内进行乙型肝炎病毒感染。感染液的配制方法为:WE中加入2%v/vDMS0、4%m/v(质量体积比)聚乙二醇8000和10%v/v高病毒滴度的病人血清(病毒滴度为2X109拷贝/ml)。配制好的感染液加入到待感染的细胞中,孵育16至24小时。感染结束后去掉感染液,用PBS清洗3次,加入新鲜含2%DMS0的维持培养液,2天换I次新鲜的培养液;收集旧培养液用作酶联免疫吸附试验,分析乙型肝炎病毒表面抗原(英文缩写为HBsAg)的分泌水平。在培养的后期,细胞固定后用免疫荧光的方法检测细胞内核心抗原(英文缩写为HBcAg)的表达;或者,将细胞裂解利用Hirt法抽提细胞内乙型肝炎病毒脱氧核酸,再通过DNA印迹(Southernblot)的方法检测各时间点乙型肝炎病毒复制中间体的产生。[0030]与现有技术相比,本发明具有以下优点:[0031]其一,本发明利用常规的肝细胞分离技术,分离得到大量的高活力人原代胎肝细胞,肝细胞数可达109,活力60%~95%;[0032]其二,本发明利用渐进冷冻的方法,通过优化的复苏条件,可以将复苏后高活力(大于70%)原代肝细胞形成致密单层,该致密单层保持良好的肝细胞形态特征、肝细胞功能与细胞增殖活力;[0033]其三,复苏后低活力(40%~70%)原代肝细胞经Percoll离心介质纯化得到高活力胎肝细胞,纯化后胎肝细胞通过优化的复苏条件形成致密单层,该致密单层保持良好的肝细胞形态特征、肝细胞功能与细胞增殖活力;[0034]其四,通过该方法复苏的原代肝细胞在铺板后6天内具有HBV易感性,极大地提高了实验的重复性,建立了稳定的抗HBV入侵药物筛选与评价的体外细胞模型;[0035]其五,本发明得到的冻存原代胎肝细胞具有数量大,保存时间长,细胞复苏后活力高且保持了完好的肝细胞功能,解决了肝细胞移植的细胞来源问题,有望应用于临床。【专利附图】【附图说明】[0036]图1为复苏后原代胎肝细胞的形态特征示意图。[0037]图2为复苏后原代胎肝细胞的肝细胞特异蛋白的表达示意图。[0038]图3为复苏后原代胎肝细胞的增殖活力示意图。[0039]图4为复苏后原代胎肝细胞对乙型肝炎病毒的易感性示意图。【具体实施方式】[0040]为了更好地解释本发明,以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容,但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。在下文中,如果未特别说明,本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。[0041]实施例1:[0042]一种对乙型肝炎病毒乙肝的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法,其步骤如下:[0043]:[0044]两步胶原酶灌注法第一步:新鲜的肝组织材料经暴露的血管用灌注溶液I灌注约30分钟,直至肝组织中血液被冲洗干净。灌注溶液I的具体配方为:***化钠、***化钾、、、、Ig/L葡萄糖、ImM***酸钠和2mM乙二醇双(2-氨基***)四乙酸,,,4°C保存。[0045]两步胶原酶灌注法第二步:用37°C预热的灌注溶液II灌注直至肝组织失去弹性。灌注溶液II的具体配方为

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