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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种家蚕浓核病毒BmDNV的PCR快速检测的方法专利名称:一种家蚕浓核病毒BmDNV的PCR快速检测的方法技术领域:本发明属于分子诊断和鉴定技术领域,具体涉及一种快速诊断家蚕浓核病毒及基因组克隆测序分析的方法。背景技术:家蚕浓核病毒(Bombyxmoridensovirus,BmDNV)是我国蚕茧生产中普遍发生的病毒病的病毒,严重威胁着蚕丝业的持续稳定生产。二十世纪七十年代初期国外应用血清学方法对家蚕病毒病进行早期诊断。此法能在蚕感病初期(感染病毒后24h48h)进行确诊。我国于七十年代后期正式开始了家蚕病毒病血清学早期诊断的研究。王裕兴等(王裕兴,曹诒孙,,1983,9(2):97-102)将免疫酶联技术应用到该病的早期诊断中,发现酶对流免疫电泳检测灵敏度比对流免疫电泳提高8倍,最早检出时间为16h,半数检出时间为21h,均比同样条件下的对流免疫电泳提早8h左右。钱元俊等(钱元骏,胡雪芳,,1984,10(3):155-157)进行了家蚕病毒病血清诊断实用化研究,研制了抗血清滤纸及其干燥保存的条件和方法;郭锡杰等(郭锡杰,钱元骏,,1985,(5):82-85)研究了用酶标组化法进行了DNV病的早期诊断;钱元俊等(钱元骏,,1989,150):217-222)进行了多种血清学诊断家蚕浓核病方法的比较研究,包括双向免疫扩散法(DID)、对流免疫电泳法(CIEP)、酶联对流免疫电泳法(ELCIEP)、酶标组化法(IEHC)、可溶性酶-抗酶法(PAP)、斑点免疫结合测定法(DIBA)、生物素-亲和素系统检测法(ABS)以及胶乳凝集试验法(LTA)等,应用这些方法可以检测出的纯化家蚕浓核病毒BmDNV的量为IX10—1IX10_40D。以DIBA法检测灵敏度最高,分别为LAT法的10倍、ELCIEP法的160倍、CIEP法的1000倍。检测蚕体DNV时,可在接种后8h40h检出,以ABS法检出阳性反应最早。PCR作为一种新的分子生物学实验技术,具有灵敏度高、快速特异、操作简单等优点,对于检测临床标本中病原体的核酸序列具有常规诊断方法无可比拟的优势,在应用于细菌、病毒的诊断与检测方面已有较多的报道并展示其良好的应用前景。近年来,在运用PCR技术诊断检测和研究家蚕浓核病毒基因方面,已经取得了可喜的进展(KageyasuS,HayakawaT,-,1997,66(6):477—483;韩序,女兆勤,高路等,家蚕浓核病毒(中国镇江株),2007,23(1)145-151;付艳红,唐顺明,(镇江),2008,34(3):453-458;余蔚,姚勤,(NSl),2008,48O)191-196)依据已经报道的家蚕浓核病毒BmDNV基因片段序列设计引物,建立了家蚕浓核病毒BmDNV的PCR诊断方法,但其检测的敏感性还有待进一步研究。本发明的目的是克服现有家蚕浓核病毒BmDNV检测技术的不足,提供一种家蚕浓核病BmDNV的PCR快速敏感的检测方法。本发明的目的通过以下技术方案予以实现;提供一种家蚕浓核病BmDNV的PCR快速检测的方法,包括以下步骤(1)提取感染家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA;(2)设计引物,对提取的家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA进行PCR检测;本申请人依据NCBI网站(.gov/)上报道的BmDNV-3的VD2ssDNA基因组的核苷酸序列资料(DQ017^,gi65306480),,拟扩增的片段为449bp。上游引物22bp,位于其5’端从2379bp到MOObp,下游引物22bp,位于从观06bp到观27bp之间的序列,两引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO3和SEQIDNO4所示VD2f5'TCATTGGCAACTGGAACTGGAG3';VD2r5'GCTTGATTACTTGCGGTTCTTA3,;,1μLdNTPs,正反向引物浓度为10μM,各加IuLjIuLDNA模板,18μLddH20,()0引物扩增的PCR循环为94°C5min;94°C45s,60°C45s,72°C45s,30循环;72°C10min,4°C保存;(3)%的琼脂糖凝胶电泳检测,用核酸染料Goldview进行染色检测。优选地,步骤(1)所述感染家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA的提取采用煮沸沉淀法,具体是取感染家蚕浓核病毒BmDNV的家蚕中肠于研钵中,,10000r/min离心10min,,并加入400μL抽提缓冲液(10mmol/LTris-HCl,;,;%SDS(十二烷基苯磺酸钠),于100°C水浴锅中煮沸裂解10min后,取出放于-20°C冰箱中冷却至室温,10000r/min离心5min将变性的蛋白沉淀,,并加入700μL预冷的异丙醇,置-20°C冰箱中冰冻30min促进沉淀形成;12000r/min离心10min沉淀DNA,并弃去上清;用1mL70%(V/V)乙醇洗涤沉淀,然后尽量弃去乙醇,自然晾干,使乙醇挥发完全,但不能使沉淀过于干燥,否则很难溶解;加入20μLTE溶液(10mmol/LTris_HCl,;lmmol/LEDTA,)或灭菌ddH20溶解沉淀,_20°C保存备用。本发明的有益效果是本发明使用煮沸沉淀法能够快速有效地提取到家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA,简捷快速,适于小量样本操作,操作简单,。使用本发明方法制备的DNA样品能够满足PCR方法对家蚕浓核病毒BmDNV进行分子诊断的需要。因此本发明建立了用煮沸沉淀法快速抽提BmDNV的模板DNA的方法,为应用PCR技术进行BmDNV的早期诊断和预知检查提供基础和技术储备;本发明设计的一对特异的引物VD2f和VD2r,大量实验证明其具有特异敏感的优越性,有效克服了现有家蚕浓核病毒BmDNV的PCR检测技术的敏感性问题。图1感染家蚕浓核病BmDNV家蚕的检测结果;图2煮沸沉淀法、煮沸法、酚-***仿法制备家蚕浓核病BmDNV模板DNA的PCR检测结果。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1本实施例分别以煮沸沉淀法、煮沸法和酚-***仿法提取的DNA为模板进行家蚕浓核病#(Bombyxmoridensovirus,BmDNV)白勺PCR本实施例以家蚕浓核病毒BmDNV(由华南农业大学蚕桑生物技术实验室经常规的桑叶添食继代繁殖获得,也可以采用本领域其他实验室或者研究院所提供的家蚕浓核病毒BmDNV)为材料,分别通过煮沸法、煮沸沉淀法、酚-***仿法(陈冬妹,林英,,2007,27(2):5_9)三种方法制备BmDNV模板DNA,再经PCR方法进行家蚕浓核病DNV的分子检测鉴定。(例如感染所述病毒的死蚕)中肠于研钵中,,10000r/min离心10min,,并加入400μL抽提缓冲液(10mmol/LTris-HCl,;,;%SDS,其余体积用水补足),于100°C水浴锅中煮沸裂解10min后,取出放于-20°C冰箱中冷却至室温,10000r/min离心5min将变性的蛋白沉淀,,并加入700μL预冷的异丙醇,置-20°C冰箱中冰冻30min促进沉淀形成;12000r/min离心10min沉淀DNA,并弃去上清;用1mL70%乙醇洗涤沉淀,然后尽量弃去乙醇,自然晾干,使乙醇挥发完全,但不能使沉淀过于干燥,否则很难溶解;加入20μLTE溶液(10mmol/LTris-HCl,;lmmol/LEDTA,)或灭菌ddH20溶解沉淀,_20°C保存备用。;取一条感染BmDNV的蚕(可以是实验用的感染BmDNV的活蚕,或者死蚕)的中肠于研钵中,,10000r/min离心10min,,并加入400μL抽提缓冲液(10mmol/LTris-HCl,;,;%SDS),于100°C水浴锅中煮沸裂解10min后,取出放于-20°C冰箱中冷却至室温,10000r/min离心5min将变性的蛋白沉淀,°C冰箱保存以备检测。***仿法抽提家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA参考陈冬妹等(陈冬妹,林英,,2007,27(2)5-9)抽提家蚕基因组DNA的方法,,加入400μL抽提缓冲液(10mmol/LTris-HCl,ρΗ8·0;,;%SDS),用枪头吹打混勻,加入蛋白酶K至终浓度为400500μg/mL,轻轻混勻,然后放入50°C水浴锅中裂解消化2-3h;向上述离心管中,加入等体积600PL的酚/***仿/异戊醇(25:24:1)混合液,在振荡器上振荡混勻;12000r/min离心10min,用去尖的枪头小心移出上层水相至另一新离心管中;加等体积的***仿,在振荡器上振荡混勻;12000r/min离心10min,取出上层水相至另一新离心管中;加入等体积预冷的异丙醇沉淀DNA,后续操作同1。、煮沸获得的病毒液、研磨离心获得病毒原液(作为对照)、酚/***仿法抽提获得家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA进行了PCR检测。依据NCBI网站(http//.gov/)上报道的家蚕浓核病毒BmDNV-3的VD2ssDNA基因组的核苷酸序列资料(DQ017^,gi65306480),,拟扩增的片段为449bp。上游引物22bp,位于其5’端从2379bp到MOObp,下游引物22bp,位于从沘06bp到沘27bp之间的序列,两引物的核苷酸序列分别为VD2f5'TCATTGGCAACTGGAACTGGAG3'VD2r5'GCTTGATTACTTGCGGTTCTTA3,上述引物由上海英俊生物技术有限公司合成。,1μLdNTPs,正反向引物浓度为ΙΟμΜ,各加lyL,lyLDNA模板,18yLddH20,()。引物扩增的PCR循环为94°C5min;94°C45s,60°C45s,72°C45s,30循环;72°C10min,4°C保存。%的琼脂糖凝胶电泳检测,用核酸染料Goldview进行染色检测。检测结果见附图2所示,附图2中,;12为煮沸沉淀法抽提家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA的PCR产物;34为煮沸法抽提家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA的PCR产物;56为家蚕浓核病毒BmDNV病毒液的PCR产物;78为酚-***仿法抽提BmDNV模板DNA的PCR产物;9为阳性对照;10为健康家蚕基因组DNA的PCR产物;11ddH20。对煮沸沉淀法、酚-***仿法制备的模板均能扩增出与设计大小相符的约449bp的明亮条带,而对煮沸法制备的模板、病毒原液、健康家蚕组织的核酸模板扩增结果均为阴性,扩增不出任何条带。实施例2(1)提取家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA;生物材料家蚕浓核病毒,由华南农业大学蚕桑生物技术实验室经桑叶添食家蚕继代繁殖(按照常规方法,为实验室为研究目的,将一定浓度的病毒液涂布在新鲜桑叶的叶背,然后喂食家蚕,使家蚕感染得病的常规实验方法);EDTA购自北京鼎国生物技术有限公司;异丙醇由天津大茂化学试剂厂出品;无水乙醇由天津大茂化学试剂厂出品。步骤(1)所述家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA的提取采用煮沸沉淀法,取感染家蚕浓核病毒BmDNV的家蚕中肠于研钵中,,10000r/min离心10min,,并加入400μL抽提缓冲液(10mmol/LTris-HCl,;,;%SDS),于100°C水浴锅中煮沸裂解10min后,取出放于_20°C冰箱中冷却至室温,10000r/min离心5min将变性的蛋白沉淀,,并加入700μL预冷的异丙醇,置-20°c冰箱中冰冻30min促进沉淀形成;12000r/min离心10min沉淀DNA,并弃去上清;用1mL70%(V/V)乙醇洗涤沉淀,然后尽量弃去乙醇,自然晾干,使乙醇挥发完全,但不能使沉淀过于干燥,否则很难溶解;加入20μLTE溶液(10mmol/LTris-HCl,;lmmol/LEDTA,)或灭菌ddH20溶解沉淀,_20°C保存备用。(2)设计引物,对提取的家蚕浓核病毒BmDNV的模板DNA进行PCR检测;依据NCBI网站(.gov/)上报道的家蚕浓核病毒BmDNV-3的VD2ssDNA基因组的核苷酸序列资料(DQ017^,gi65306480),,拟扩增的片段为449bp。上游引物22bp,位于其5’端从2379bp到M00bp,下游引物22bp,位于从观06bp到观27bp之间的序

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