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一种呼吸道合胞病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用的制作方法.docx

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一种呼吸道合胞病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用的制作方法.docx

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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种呼吸道合胞病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用的制作方法一种呼吸道合胞病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用的制作方法本发明属于生物【技术领域】,具体涉及一种呼吸道合胞病毒(RSV)病毒样颗粒(VLPs)亚单位疫苗、制备方法及应用。本发明涉及的疫苗组分是以乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)为载体、与RSVG蛋白的中和抗原表位或同时与M2蛋白T细胞抗原表位融合表达的嵌合抗原蛋白。抗原蛋白能在大肠杆菌高效表达,经体外纯化、变性和复性制备了高纯度抗原组分,并自组装成病毒样颗粒(VLPs)。VLPs所含的RSVG蛋白与M2蛋白T细胞抗原表位同时表达,增强了疫苗诱导特异性免疫应答和抗RSV感染免疫保护的能力,并能诱导平衡的Th1/Th2类免疫应答和防止RSV疫苗增强疾病发生。应用所发明的VLPs疫苗免疫接种动物,诱导机体产生高水平RSV中和抗体、增强的Th1类细胞因子水平和针对RSV攻击感染的有效保护。【专利说明】一种呼吸道合胞病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用【技术领域】[0001]本发明涉及一种嵌合表达呼吸道合胞病毒多表位抗原的病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用,属于生物【技术领域】,用于人和易感动物呼吸道合胞病毒感染的免疫预防。【背景技术】[0002]呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytialVirus,RSV)是全球范围内引起婴幼儿下呼吸道感染并导致其罹患细支气管炎和肺炎,严重可导致支气管哮喘甚至死亡的重要病原体之一,几乎所有儿童两岁前感染过至少一次RSV(Black,2003)。年龄越小病情越重,再感染率高,与哮喘发生密切相关;免疫缺陷者更易感染,临床症状更为严重,常致死亡(HoltandSly,2002;Meissneretal.,2004)。老年人和免疫缺陷病人也是RSV的易感染人群。人感染RSV后不能产生针对RSV感染的有效免疫保护,因此,RSV易反复感染引起疾病。近年来,因RSV感染住院并导致死亡的病例逐年上升。[0003]RSV属于副粘病毒科、肺炎病毒属中的成员,其基因组为非节段的单负链RNA,由15225个核苷酸组成。RSV基因组编码至少11种蛋白质,基因组RNA从3'至5'端编码的蛋白依次为NSl、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2(M2-l、M2-2)和L等,其中表面蛋白糖蛋白G和融合蛋白F是主要中和抗原成分。机体感染RSV后,病毒编码的G和F抗原蛋白能刺激机体免疫应答,产生血清IgG中和抗体和呼吸道黏膜的分泌型IgA抗体。血清中和抗体和呼吸道分泌型IgA是抗RSV感染的主要物质。此外,M2蛋白第82-90位氨基酸是一个有效的细胞毒了淋巴细胞表位(CytotoxicTlymphocyteepitopes,CTL),能够显著激活⑶8+T细胞免疫应答,抑制Th2类反应,降低疫苗增强性疾病(ineEnhanceDisease,VED)发生,在抗RSV感染和减轻VED中具有重要作用。[0004]目前,针对RSV感染疾病治疗的主要药物是利巴韦林(Ribavirin),一类鸟嘌呤核苷类似物,可以阻止病毒RNA的合成及病毒mRNA的加帽,但该药物治疗效果有限。用于预防高危婴幼儿感染RSV的药物有帕利珠单抗(palivizumab),一种针对RSV表面融合蛋白F的单克隆抗体。该药物生产成本高,需要提前注射且持续注射5个月才能达到预防效果,因此难以推广应用。与其它病毒性传染病一样,疫苗接种应该成为预防RSV感染有效策略。在上世纪60年代,人们制备了用福尔马林灭活RSV的传统灭活疫苗(ine,FIV),临床试验证实,该FIV疫苗接种后不仅没能防止婴幼儿感染RSV,疫苗接种个体在随后的RSV自然感染中,支气管炎和肺炎发生率及疾病的严重程度均大大增力口,入院治疗人数明显上升,出现疫苗接种儿童死亡病例(Kimetal.,1969)。随后,RSV疫苗研制一直是RSV感染性疾病防治的重点,但至今仍无有效的RSV疫苗获得批准上市使用。世界卫生组织(WHO)也将RSV疫苗列为全球疫苗计划的优先发展疫苗之一。[0005]FIV疫苗接种不能诱导机体有效的抗病毒免疫应答和引起VED,是当前RSV疫苗研发的主要障碍。其原因在于,FIV接种不能诱导机体产生高水平中和抗体,未能诱导抗病毒效应⑶8+T细胞免疫应答,宿主Thl/Th2比例及Thl、Th2产生的细胞因子比例失衡等所致。而FIV接种诱导机体产生的IgE抗体,以及IL-4、IL-5和IL-10等为主的Th2偏向的⑶4+T细胞应答在导致VED中起重要作用。提高疫苗诱导产生中和抗体能力、诱导更高效的CD8+T细胞免疫应答,以及更平衡的Thl/Th2比例,是发展新型RSV疫苗的关键(Murata,2009)。[0006]亚单位疫苗是发展RSV疫苗的重要方向之一,近年来有诸多文献报道。已有相关的专利报道包括:有发明人以无毒型大肠杆菌热不稳定肠***LT为佐剂,融合表达RSVG蛋白aal30-230区域,并将其中的aal82-186之间氨基酸替换成RSVM蛋白的TCL表位(YLEKESIYY),发明了Gcti亚单位疫苗(专利号:)。另有发明人采用DsbA为载体蛋白,表达RSVF/M2肽段,制备用于预防RSV感染的亚单位疫苗(专利号:)。特别是近来,有发明人以腺病毒为载体,将RSV的M、F和G蛋白基因重组至基因组中制备了重组腺病毒,该重组腺病毒感染哺乳动物Vero细胞后,表达M、F和G蛋白并组装产生病毒样颗粒,免疫动物能诱导机体抗RSV感染的有效保护(专利申请号:)〇[0007]病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs)是由病毒结构蛋白自行装配而成的高度结构化的蛋白颗粒,缺乏病毒核酸,无感染性。VLPs表面能够重复高密度展示外源抗原表位,从而诱导高效免疫应答。近来的研究表明,一些VLPs能有效通过MHCI类和MHCII类抗原递呈途径递呈抗原,诱导CTL应答,激发Thl和Th2型细胞免疫反应,一些病毒的VLPs可诱导树突状细胞和单核巨噬细胞群的成熟和细胞因子的表达。因此,应用嵌合病毒样颗粒抗原制备疫苗具有安全高效的特点。[0008]人乙型肝炎病毒(HBV)的核心抗原(HBc)在病毒感染过程能够自发组装成病毒样颗粒,包裹病毒的核酸。HBc自发形成的病毒样颗粒有两种大小,分别为由180个和240个单体核心抗原组成的二十面体(Wynneetal.,1999)。HBc全长为183AA,其中75-82AA为抗原显现区,展示在病毒样粒子表面,构成中间穗状区。HBc的C末端39个AA富含精氨酸,具有结合包装病毒核酸的功能,去除后不影响HBc形成病毒样颗粒。截短后的HBc能在大肠杆菌中高效表达,并自主装配成病毒样颗粒,HBc的中间穗状区和截短后的C末段都暴露在病毒粒子的表面,该区域可融合表达外源的抗原表位(Birkettetal.,2002)。一些融合外源B细胞抗原表位或T细胞抗原表位的HBc仍可组装成嵌合VLPs,诱导免疫动物产生强烈的免疫应答(PumpensandGrens,2001)。采用大肠杆菌表达的HBc能形成具有天然结构的HBc颗粒,可用于构建表达不同抗原片段的VLPs疫苗。作为一种新型的抗原表位递呈系统,HBc载体蛋白已应用于流感病毒,艾滋病毒和结核分枝杆菌等病原体的疫苗研制(DeFiletteetal.,2006;Gonzalezetal.,2009;al.,2011)〇[0009]本发明在充分借鉴已有成果的基础上,通过优化设计、实验筛选,发明了基于HBc为载体蛋白,包含有RSVG蛋白保守抗原结构和M2蛋白CTL表位,在大肠杆菌中表达形成病毒样颗粒的亚单位疫苗,该病毒样颗粒亚单位疫苗可用于预防人和动物抵抗RSV的感染,具有重要的科学和应用价值。【发明内容】[0010]技术问题[0011]本发明的目的是提供一种新型的呼吸道合胞病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用。该疫苗安全高效,不含感染性病毒核酸,抗原纯度高,模拟抗原蛋白的天然结构,免疫接种能诱导机体产生抗呼吸道合胞病毒感染的保护性免疫应答。用于人和动物呼吸道合胞病毒感染引起的呼吸道疾患的免疫预防。[0012]技术方案[0013]本发明提供了一种呼吸道合胞病毒样颗粒,包含以截短的乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcl-144aa)为载体,嵌合其中的RSVG蛋白中和抗原表位,可自主装配的病毒样颗粒。[0014]本发明进一步提供一种在上述乙肝病毒核心蛋白C末端还融合了RSVM2蛋白的CTL表位,可自主装配的病毒样颗粒。[0015]其中以截短的乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcl-144aa)为载体,将RSV编码的G蛋白保守B细胞表位的抗原片段(G144_204aa)(Plotnicky-al.,1999)插入HBc肽段的Asp78与Pro80之间;或同时将RSV编码的M2蛋白的CTL表位82-90aa(M282_9Q)融合在截短蛋白HBcl-144aa的C末端,该M282_9Q表位能有效激活机体⑶8+T淋巴细胞免疫反应(SrikiatkhachornandBraciale,1997)。经密码子优化设计、筛选,获得了由编码HBc的l-144aa与RSVG蛋白的144_204aa核苷酸序列融合的基因片段(HBc-tG,)和由编码HBc的l-144aa与RSVG蛋白的144-204aa及M2蛋白82-90aa核苷酸序列融合的基因片段(耶^6肩282_9(|,),将其分别克隆到表达载体?£128中,构建重组表达质粒pHBc-tG和pHBc-tG/M282_9(l。将pHBc-tG和pHBc-tG/M282_9(l转化大肠杆菌,筛选用于病毒样颗粒(VLPs)疫苗生产、特性稳定的工程菌株;经优化培养条件,高效表达了融合蛋白HBc-tG和HBc-tG/M282_9(l。采用包涵体分离、蛋白质亲和层析纯化及体外复性自组装等相结合的技术路线,纯化制备用于免疫接种的VLPs制品。[0016]呼吸道合胞病毒样颗粒抗原用PBS稀释至适当浓度,制备成本发明所述的呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗。[0017]本发明获得的呼吸道合胞病毒病毒样颗粒抗原还可用于呼吸道合胞病毒感染诊断试剂或诊断试剂盒。[0018]有益效果[0019]呼吸道合胞病毒颗粒疫苗接种小鼠诱导产生病原特异性中和抗体,第三次免疫2周后,小鼠获得抵抗致死剂量(3XIO6PFU/只)呼吸道合胞病毒攻击感染的效力,并显示出较强的免疫记忆,诱导高效的⑶8+T细胞应答,平衡的Thl/Th2比例和对呼吸道合胞病毒强毒攻击感染小鼠100%保护效率。【专利附图】【附图说明】[0020]图1为设计合成的RSV嵌合抗原蛋白基因克隆载体质粒(为本发明设计,委托商业公司合成)。[0021]图2为重组表达质粒pHBc-tG和pHBc-tG/M282_9Q构建示意图。[0022]图3为本发明设计的HBc-tG和HBc-tG/M282_9Q重组疫苗蛋白组分鉴定。[0023]A、工程菌表达HBc-tG和HBc-tG/M282_9(l重组疫苗蛋白组分SDS-PAGE分析(M:分子量Marker;1、3为表达HBc-tG工程菌加IPTG诱导前后的菌体蛋白;2、4为表达HBc-tG//M282_9Q工程菌加IPTG诱导前后的菌体蛋白);B、SDS-PAGE检测纯化的疫苗成分(M:分子量Marker;1:HBc-tG;2:HBc-tG/M282_9Q);C、WesternBlot检测疫苗成分的免疫反应性(anti-tG抗体;M:分子量Marker;1:HBc_tG;2:HBc_tG/M282_90)。[0024]图4为磷钨酸负染后病毒样颗粒(VLPs)透射电镜TEM观察。[0025]A、HBc-tG颗粒;B、HBc-tG/M282_9Q颗粒;[0026]图5为UV灭活RSV和两种病毒样颗粒(VLPs)疫苗免疫小鼠体液免疫应答检测(A、血清总IgG和IgGl及IgG2a亚类抗体滴度;B、亚类IgG2a/IgGl比值;C、中和抗体滴度。[0027]图6为UV灭活RSV和两种病毒样颗粒(VLPs)疫苗免疫小鼠脾淋巴细胞分泌ThUTh2类细胞因子水平。[0028]A、Thl类细胞因子;B、Th2类细胞因子;[0029]图7为UV灭活RSV和两种病毒样颗粒(VLPs)疫苗免疫小鼠RSV攻毒感染后肺组织分泌Thl和Th2类细胞因子水平。[0030]A、Thl类细胞因子;B、Th2类细胞因子;[0031]图8为UV灭活RSV和两种病毒样颗粒(VLPs)疫苗免疫小鼠RSV攻毒感染后肺组织RSV滴度比较。[0032]图9为UV灭活RSV和两种病毒样颗粒(VLPs)疫苗免疫小鼠RSV攻毒感染后肺组织病理分析(肺组织切片染色观察)。[0033]A、UV灭活RSV疫苗免疫小鼠;B、HBc-tG颗粒疫苗免疫小鼠;C、HBc-tG/M282_9Q颗粒疫苗免疫小鼠;D、正常小鼠;【具体实施方式】[0034]现结合以下实施例来更加详细地描述本发明。提供这些实施例的目的仅在于示例性地说明本发明,不能将其理解为是对本发明的范围和实质的限制。[0035]下列实施例中未注明的具体实验条件和方法,,科学出版社,1992,分子克隆实验指南(第三版);,科学出版社,2001,细胞实验指南等书中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。[0036]本发明中所使用的术语,除非有另外说明,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。[0037]【实施例1】呼吸道合胞病毒病毒样颗粒(VLPs)的构建与检测

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