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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。一种含有更多丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶gpx1突变体及其制备方法一种含有更多丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶gpx1突变体及其制备方法一种含有更多丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体及其制备方法,属于生物【技术领域】。先用基因突变或合成法获得突变体基因,再通过营养缺陷型原核表达系统或营养缺陷型和SPP低温联合表达系统,将GPX的催化基团SeCys引入到突变体的底物结合部位,结果赋予其高的GPX的活性;或者先将靶基因连同SeCys插入序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上,再将SeCys插入序列结合蛋白2组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上,将两种载体共转染同一哺乳细胞株,在亚硒酸钠存在下用哺乳细胞合成GPX。本发明方法简单,突变体活力和产量高、稳定性好,避免包涵体复性造成的产率下降和失活,从而解决天然GPX来源有限和性质不稳定问题。【专利说明】一种含有更多丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体及其制备方法[0001]本专利申请是中国专利“高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体及其制备方法”的分案申请,原申请的申请日为:2013-07-18,原申请的申请号为:,103320406A。【技术领域】[0002]本发明属于生物【技术领域】,具体涉及一种含有更多丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体及其制备方法。【背景技术】[0003]含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH),催化基团是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物体内,GPX同超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)—起构成了机体抗氧化防御体系。GPX在该体系中发挥着重要的作用,它以底物GSH为还原剂,分解体内的过氧化氢和各类氢过氧化物,因而能清除体内活性氧(R0S),防止脂质过氧化,治疗由活性氧引起的各种疾病,如衰老、紫外线辐射、心脑血管疾病、白内障、肿瘤等。与其它抗氧化酶不同,GPX除了能清除ROS外,还能降解脂质过氧化物,防止细胞过氧化损伤,这种独特的保护细胞的功能使它在抗氧化酶体系中占有特别重要的位置。然而,由于天然GPX的来源相当有限、稳定性差,致使它的人工产物及其模拟物的研究备受关注。[0004]小分子模拟物主要有PZ51(ebSelen)、AL3823A、BXT系列产品,它们的弱点是活力低,仅为天然GPX的千分之一左右。大分子的模拟物主要有抗体酶()和以谷胱甘肽硫转移酶(GST)为蛋白模板制备的GPX模拟酶,其活力显著高于小分子模拟物。显然,以具有谷胱甘肽(GSH)结合部位的蛋白为模板制备的大分子GPX模拟酶收到了更好的效果,因此开发制备这些高活力的GPX模拟酶制备技术就成了学术界的研究热点,对于分子生物学、生物工程学及医学等领域具有广阔的应用前景。迄今已成功开发的方法有:用化学法(,)或营养缺陷型原核表达系统()在非GPX类模板蛋白中引入GPX的催化基团硒代半胱氨酸(SeCys)。[0005],,,(修饰)法在抗体类模板蛋白中引入GPX的催化基团SeCys,有以下缺点:(I)在制备过程中,仅化学突变(修饰)这一步就会损失20_40%的酶蛋白,导致模拟酶产率显著下降;(2)制备模拟酶的周期长,操作繁琐,时间长;(3)在化学突变过程中需使用苯***磺酰***、乙***等,这些物质为有毒性的物质;(4)缺乏靶向性,对于大的蛋白分子而言,一次化学反应常在不同位点引入多个非特异性催化基团,因此化学突变引入催化基团无法达到基因突变法那样的专一性。[0006](大肠杆菌)和基因突变法引入催化基团,但其仅限于人源单链含硒抗体酶的制备,不包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)突变体及其它GPX模拟酶的制备方法。具有GPX活性的谷胱甘肽硫转移酶(GST)的制备方法(Yu,.,Liu,.,Bock,A.,Li,J.,Luo,.,andShen,,280,11930-11935)亦见报道,这种方法虽然也采用营养缺陷型原核表达系统和基因突变法引入催化基团,但其仅限于以GST为模板蛋白制备GPX模拟酶,不包括以天然GPX为模板制备GPX突变体。用营养缺陷型原核表达系统在非GPX类模板蛋白中引入催化基团制备模拟酶的方法是将催化基团引入到与GPX有相同底物GSH结合部位的它种蛋白中使其产生GPX活力。[0007]然而由于这些模板蛋白不具备天然GPX自身的催化基团,因此很难找到理想而准确的催化基团的位置;同时由于这些模板蛋白中也没有象天然GPX那样理想的催化三联体,因此这类模拟酶的催化效率不高。如果以天然GPX为模板用基因工程方法来制备GPX突变体则可克服这些缺点。由于编码GPX的催化基团SeCys的密码子UGA是终止密码子,在普通原核表达系统中,需在GPX基因的开放阅读框内、紧邻SeCys的密码子UGA下游引入颈环结构才能将UGA翻译成SeCys而不是终止密码子,而开放阅读框内颈环的引入必然会引起GPX空间构象的改变,进而影响酶活性。因此普通原核表达系统不适于直接表达具有GPX活性的含硒蛋白。【发明内容】[0008]本发明的目的在于提供一种含有更多丝氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体及其制备方法。[0009]应用基因工程技术、细胞培养技术、营养缺陷型原核表达技术和SPP(Singleproteinproduction,单一蛋白生产)系统低温表达技术制备具有极高GPX活力的GPXl突变体。是用基因工程技术在哺乳动物细胞株或营养缺陷型原核表达系统及其SPP低温表达系统中直接表达具有高酶活性的GPXl突变体蛋白的方法。本方法不需化学修饰即可制备具有极高GPX活力的新型人工酶。本发明方法在生物制药方面具有广阔的应用前景。[0010]本发明以人GPXl(参见NCBI,)为模板,通过计算机模拟和定点突变,得到一种新型的高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体,其由203个氨基酸组成,与人GPXl相比较,其不含有半胱氨酸,具有更高的GPX活力和更好的稳定性,其是将GPXl中所有半胱氨酸突变成丝氨酸,但第49位仍然是硒代半胱氨酸(SeCys,单字母缩写为U,序列表中写成Xaa)。所述的GPXl突变体的氨基酸序列(SEQIDNo:1)如下所示:[0011]MSAARLAAAAAAAQSVYAFSARPLAGGEPVSLGSLRGKVLLIENVASLUGTTVRDYTQMNELQRRLGPRGLVVLGFPSNQFGHQENAKNEEILNSLKYVRPGGGFEPNFMLFEKSEVNGAGAHPLFAFLREALPAPSDDATALMTDPKLITWSPVSRNDVAWNFEKFLVGPDGVPLRRYSRRFQTIDIEPDIEALLSQGPSSA[0012]进一步,所述的GPXl突变体的具体氨基酸序列还包括,将上述氨基酸序列中任何一个或多个丙氨酸(Ala)突变为丝氨酸(Ser)所形成的任何一个新型GPXl突变体。比如将87位丙氨酸(Ala)突变为丝氨酸(Ser),所形成的序列为SEQIDNo:2(实施例9)。[0013]进一步,所述的GPXl突变体的具体氨基酸序列还包括,将上述氨基酸序列中第2、78、115、156、202位5个丝氨酸的任何一个或多个被硒代半胱氨酸取代后所形成的任何一个新型GPXl突变体。比如第2位丝氨酸被硒代半胱氨酸(序列表中写成Xaa)取代后所形成的序列SEQIDNo:3(实施例10)。[0014]进一步,所述的GPXl突变体的具体氨基酸序列还包括,由于使用了便于靶蛋白纯化的pColdl(TAKARA公司)等分泌型原核或真核表达载体而在上述氨基酸序列的氨基端或羧基端引入该载体上的组氨酸纯化标签和其它的氨基酸等所形成的任何一个新型GPXl突变体。比如在序列SEQIDNo:USEQIDNo:2和SEQIDNo:3的氨基端引入pCoIdKTAKARA公司)原核表达载体的组氨酸纯化标签和凝血因子Xa切割位点的氨基酸后所形成的序列SEQIDNo:4,SEQIDNo:5和SEQIDNo:6(实施例11)。[0015]本发明的制备高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体的方法,具体包括如下方法:[0016]方法1:[0017]先合成靶基因并组装到分泌型原核表达载体上或先将GPXl基因组装到分泌型原核表达载体上,用基因突变(或氨基酸替换)法获取靶基因,再通过营养缺陷型原核表达系统或通过营养缺陷型原核和SPP低温联合表达系统,将GPX的催化基团硒代半胱氨酸(SeCys)引入到GPXl突变体的底物结合部位,因而在该蛋白上既有GPX的底物结合部位,又有GPX的催化基团和催化三联体,结果赋予其极高的GPX的活性,就产生了高活力的谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体。方法2:[0018]或先将编码GPXl突变体的基因连同硒代半胱氨酸插入序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上,再将硒代半胱氨酸插入序列结合蛋白2(SBP2)组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上,将两种载体共转染同一哺乳类细胞株,然后用筛选得到的同时含有GPXl突变体和SBP2两种基因的阳性细胞株制备GPXl突变体蛋白,就在体外产生了高活力的基因工程谷胱甘肽过氧化物酶GPXl突变体,从而解决天然GPX来源有限的问题。[0019]本发明的具体制备步骤:[0020]本发明的第一种方法是先在生物公司用DNA合成仪人工合成能够表达本发明所述的GPXl突变体蛋白的基因,确保基因中不含ACA序列,再用单一蛋白生产系统和营养缺陷型原核表达系统联合制备GPXl突变体蛋白。[0021]1)、表达载体的构建:根据本发明所述GPXl突变体的氨基酸序列,在生物公司用DNA合成仪人工合成能在营养缺陷型菌株中表达GPXl突变体蛋白的基因,确保靶基因的5'端含有起始密码子(ATG),3'端含有终止密码子,且两端都含有特定的酶切位点,确保靶基因的49位硒代半胱氨酸(SeCys)的编码序列替换为半胱氨酸(Cys)的密码子(可以是TGC等),且基因全长不含有ACA序列;具体的基因序列可以是将GPXl基因(参见NCBI,)中第2、78、115、156和202位的半胱氨酸的编码序列替换为丝氨酸的密码子,第49位硒代半胱氨酸的密码子替换为半胱氨酸的密码子,并根据密码子的简并性,在不改变氨基酸序列的前提下,将基因中所有的ACA序列全部替换为非ACA序列所得到的编码基因,也可以是其它任何一种能在营养缺陷型菌株中表达GPXl突变体蛋白,且全长不含有ACA序列的编码基因(由于密码子的简并性,同一氨基酸序列可以有多种不同的编码基因);用相同的限制性核酸内切酶切割两端含特定酶切位点的GPXl突变体基因和分泌型原核表达载体(如PCold系列等),再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl突变体基因组装到分泌型原核表达载体上;所述的特定的酶切位点可以是表达载体的多克隆位点中含有的而GPXl突变体基因中不存在的任何一个酶切位点,是载体上固有的由限制性核酸内切酶识别的碱基组成的DNA序列;[0022]2)、阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化:[0023]用步骤I)中构建的含有GPXl突变体基因的表达载体转化营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys的感受态细胞,涂含Cys的营养琼脂平板,筛选阳性菌株;再将含有表达核酸内切酶MazF的pMazF(TAKARA,Cat#3367)质粒转化阳性菌株,用含双抗性的M9固体培养基筛选阳性转化子;将阳性转化子扩培养后,在含有SeCys、必需生长因子和营养素的培养基里,经IPTG低温4-25°C诱导表达,营养缺陷型菌株-BL21(DE3)Cys能用Cys的密码子合成SeCys,直接表达出在底物GSH的结合部位含有SeCys的GPXl突变体,酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里,而MazF能通过识别并切断单链RNA特定序列ACA,抑制宿主蛋白质的表达;先小量培养筛选高表达株,再扩大培养和诱导表达;收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白,将液体低温离心,去除菌体沉淀、获得上清液;用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPXl突变体蛋白,透析冻干后即得GPXl突变体蛋白纯品。用变性聚丙烯酰***凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Westernblot)鉴定目标蛋白。[0024]该方法通过低温下诱导营养缺陷型原核表达系统在GPXl突变体的底物结合部位引入了催化基团,因而产生高活力的GPXl突变体。[0025]所述的用谷胱甘肽(GSH)亲和层析纯化GPXl突变体蛋白,,50mmol/LTris-Cl平衡并洗脱杂蛋白,用含lOmmol/LGSH的缓冲液洗脱目的蛋白。[0026]所述的将液体低温离心,可以在4°C,8000_12000g离心15_30min。[0027]本发明的第二种方法是先扩增GPXl基因,然后以其为模板,用基因突变法获得能表达本发明所述的GPXl突变体蛋白的基因,并在保证其氨基酸序列不变的前提下突变掉基因中的ACA序列,获得不含ACA的GPXl突变体基因,再用单一蛋白生产系统和营养缺陷型原核表达系统联合制备GPXl突变体蛋白。[0028]1)、表达载体的构建:[0029]根据基因文库中公开的GPXl的基因序列(参见NCBI,)设计引物,扩增其编码基因,在设计引物时,确保基因的5'端含有起始密码子(ATG),3'端含有终止密码子,且两端都含有特定的酶切位点,确保第2和202位Cys的密码子替换成Ser的密码子,其它氨基酸序列不变;用相同的限制性核酸内切酶切割载体和靶基因后,再用DNA连接酶通过特定的酶切位点将GPXl基因组装到分泌型原核表达载体上(如pCold系列等);在保持其它氨基酸序列不变的前提下,根据GPXl中要突变为半胱氨酸的49位硒代半胱氨酸和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物,以突变氨基酸的密码子为中心,引物长