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一种副溶血性弧菌分子检测方法及使用的引物对的制作方法.docx

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一种副溶血性弧菌分子检测方法及使用的引物对的制作方法.docx

上传人:开心果 2024/4/17 文件大小:20 KB

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文档介绍:该【一种副溶血性弧菌分子检测方法及使用的引物对的制作方法 】是由【开心果】上传分享,文档一共【9】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【一种副溶血性弧菌分子检测方法及使用的引物对的制作方法 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种副溶血性弧菌分子检测方法及使用的引物对的制作方法一种副溶血性弧菌分子检测方法及使用的引物对的制作方法本发明公开了一种副溶血性弧菌分子检测方法及使用的引物对。一对用于副溶血性弧菌分子检测的特异性引物对,上游引物toxRS-F为SEQ?ID?,下游引物toxRS-R为SEQ?ID?。种副溶血性弧菌分子检测方法,使用所述的特异性引物PCR扩增待检样品的DNA,如果能够扩增得到679bp的片段,则说明待检样品中含有副溶血性弧菌。本发明方法操作简便,检测周期短,特异性好,检出限低,检测结果准确、稳定,适应食品微生物检验发展的需要,具有较高的使用推广价值。【专利说明】—种副溶血性弧菌分子检测方法及使用的引物对【技术领域】[0001]本发明属于生物检测领域,涉及一种副溶血性弧菌分子检测方法及使用的引物对。【背景技术】[0002]副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus,Vp)是一种革兰氏阴性嗜盐性细菌,属弧菌科(Vibrio)弧菌属,主要存在于近海岸的海水、海底沉积物和鱼类、虾类、贝类、牡蛎等海产品中。人多因食用被本菌污染而又未煮熟的海产品而引起中毒。我国每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的报道,近年来世界发病率呈上升趋势。目前,对于副溶血弧菌的传统检测方法大多要经过前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定、神奈川现象和血清学反应等过程。这些实验操作繁琐,需耗时5-6天,给海产品生产、出入境检验检疫、食品卫生监督等带来困难,影响经济发展。目前,学者对副溶血弧菌的分子检测的方法大多基于tlh、tdh、gyrb、pr72H等基因,但大多方法被后来的试验数据否定,而现在缺乏可被公众认可的分子检测方法。故建立一种简便、快速特异而严谨的分子检测技术迫在眉睫。【发明内容】[0003]本发明的目的是针对现有技术的上述不足,提供一对用于副溶血性弧菌分子检测的特异性引物对。[0004]本发明的另一目的是提供该引物对的应用。[0005]本发明的又一目的是提供一种副溶血性弧菌分子检测方法。[0006]本发明的目的可通过以下技术方案实现:[0007]本发明引物设计和分子检测方法的建立基于副溶血性弧菌的toxRS基因。ToxRS,即toxR和toxS,为弧菌的***操纵子基因,toxS基因序列位于toxR下游,两者的连续基因合称为toxRS。基于该基因的可变区设计引物,建立副溶血弧菌的分子检测方法。[0008]一对用于副溶血性弧菌分子检测的特异性引物对,上游引物toxRS-,下游引物toxRS-。[0009]本发明所述的引物对在制备检测副溶血性弧菌的检测试剂中的应用。[0010]一种用于副溶血性弧菌分子检测的试剂盒,包含本发明所述的特异性引物对。[0011]本发明所述的试剂盒,还包含TaqPCRMasterMix。[0012]本发明所述的引物对在检测副溶血性弧菌中的应用。[0013]一种副溶血性弧菌分子检测方法,使用所述的特异性引物PCR扩增待检样品的DNA,如果能够扩增得到679bp的片段,则说明待检样品中含有副溶血性弧菌。[0014]所述PCR扩增的反应体系为25μI:,,上游、下游引物各Iμ1,DNA模板IμI;反应程序为:94°C预变性5min,94°C变性30s,59°C退火30s,72。。延伸45s,共30个循环,最后72°C延伸IOmin0[0015]有益效果:[0016]副溶血性弧菌PCR检测方法的建立,要求既不能出现假阳性一即严格的种特异性,也不能出现漏检——即重复性良好,故要选择种特异性的靶基因,并排除特异血清型、亚型以及毒力基因序列。本发明在参考大量文献以及分析基因序列的基础上,排除毒力基因、亚型以及血清型特异基因,锁定副溶血弧菌可能存在的种特异性序列。引物的特异性与靶基因的特异性的起着同等重要的作用,对于副溶血性弧菌的检测特异性和灵敏度具有着重大的影响。本发明经过反复比对和筛选,确定了以toxRS基因()的第579—1258个碱基作为靶序列,并设计了特异性引物对toxRS-F/toxRS-R,从理论层面保证本方法具有很高的特异性。[0017]本试验用2XTaqPCRMasterMix替代传统PCR体系中的lOXbuffer、MgC12、dNTP、Taq酶,省时省力且减小操作误差。PCR程序中,较高的退火温度能在一定程度上能提高引物的特异性,但并不代表越高越好。故应在能遵循特异性、重复性、灵敏性良好的基础上,选择最高的退火温度。试验结果证明,59°C为最适退火温度。最终确定的PCR程序参数为:94°C预变性5min,94°C变性30s,59。。退火30s,72。。延伸45s,共30个循环,最后72°C延伸IOmin0[0018]经51株副溶血性弧菌、10株亲缘相近细菌以及9株食源性致病细菌的检测表明,本发明引物对PCR扩增具有良好的副溶血弧菌特异性和重复性,未发现霍乱弧菌、河流弧菌等亲缘相近菌以及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌等食源性致病菌扩增出任何条带。经试验,本方法的检测极限可达到2pg/y1,即有极其微量的阳性基因组即可检出阳性结果。纯培养的细菌,鉴定时间仅需3-4h,明显短于常规检验方法。由此表明,本发明方法操作简便,检测周期短,特异性好,检出限低,检测结果准确、稳定,适应食品微生物检验发展的需要,具有较高的使用推广价值。【专利附图】【附图说明】[0019]-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》副溶血性弧菌分离鉴定基本流程。[0020]图2温度梯度PCR结果[0021]M:Marker,I:58°C,2:59°C,3:60°C,4:61°C,5:62°C,6:63°C,7:64°C。[0022]图3亲缘相近菌PCR扩增结果[0023]M:Marker,1:副溶血性弧菌(33847),2:溶藻弧菌,3:霍乱弧菌,4:创伤弧菌,5:拟态弧菌,6:哈维弧菌,7:河流弧菌,8:弗氏弧菌,9:嗜水气单胞菌,10:荧光假单胞菌,11:铜绿假单胞菌,12:阴性对照(无模板)[0024]图4食源性致病菌对比试验[0025]MiMarker,1:副溶血性弧菌(33847),2:产单核李氏杆菌,3:大肠杆菌,4:沙门氏菌,5:粪肠球菌,6:福氏志贺菌,7:金黄色葡萄球菌,8:奇异变形杆菌,9:产气荚膜梭菌,[0026]10:多杀性巴氏杆菌,11:阴性对照(无模板)[0027]图5副溶血弧菌分离株的PCR扩增[0028]M:Marker,1:副溶血性弧菌(33847),2:Vpl,3:Vp2,4:Vp3,5:Vp4,6:Vp5,7:Vp6,8:Vp7,9:Vp8,10:Vp9,llVplO,12:Vpll7,13:Vpl2,14:Vpl3,15:Vpl4,16:Vpl5,17:Vpl6,18:Vpl7,19:Vpl8,20:Vpl9,21:Vp20,22:Vp21,23:Vp22,24:Vp23,25:Vp24,26:Vp27;27:Vp26,28:Vp27,29:Vp28,30:Vp29,31:Vp30,32:Vp31,33:Vp32,34:Vp33,35:Vp34,36:Vp35,37:Vp36,38:Vp37,39:Vp38,40:Vp39,41:Vp40,42:Vp41,43:Vp42,44:Vp43,45:Vp44,46:Vp45,47:Vp46,48:Vp47,49:Vp48,50:Vp49,51:Vp50,52:Vp51,53:阴性对照(无模板)[0029]图6不同模板量的PCR扩增[0030]M:Marker,I:20ng,2:2ng,3:200pg,4:20pg,5:2pg,6:阴性对照(无模板)【具体实施方式】[0031]I试验材料[0032][0033]本试验使用菌株:33847,副溶血性弧菌样品分离株51株(详情见表1),溶藻弧菌(17749)、河流弧菌(33809)、弗氏弧菌(33841)、荧光假单胞(17571)、福氏志贺菌购于中国微生物菌种保藏中心,创伤弧菌(27562)、拟态弧菌购于中国工业微生物菌种保藏中心,非01霍乱弧菌、铜绿假单胞菌(27853)购于广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心,产单核李氏杆菌,金黄色葡萄球菌(29213)、大肠杆菌、粪肠球菌(29212)、奇异变形杆菌、肠炎沙门氏菌、哈维弧菌、产气荚膜梭菌、嗜水气单胞菌、多杀性巴氏杆。[0034][0035]细菌DNA提取试剂盒购自天根生物科技有限公司,2XTaqPCRMasterMix购自南京诺唯赞生物技术有限公司,ddH2O,DNAMarker购自大连宝生物工程有限公司,引物由北京鼎国引物合成部合成,琼脂糖粉、TAE缓冲液、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂(TCBS)培养基、科玛嘉弧菌培养基购自上海科玛嘉公司,梅里埃全自动生化试验板购自梅里埃中国公司,GoldView核酸染色剂等购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。仪器主要有S1000TMThermalCycler基因扩增仪,凝胶成像系统(biorad)、梅里埃全自动生物鉴定系统等。[0036]2方法[0037][0038]本试验参照国家标准GB/-2008《食品卫生微生物学检验副溶血弧菌检验》-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》(如图1)对样品中的副溶血弧菌进行分离鉴定。该检测方法需要经过前增菌、增菌、选择平板分离、生化试验、神奈川试验和血清学分型等步骤。以下实施例中涉及的副溶血弧菌样品分离株见表1。[0039]表1副溶血弧菌样品分离株[0040]【权利要求】,其特征在于上游引物t0XRS-,下游引物toxRS-。。,其特征在于包含权利要求1所述的特异性引物对。,其特征在于还包含TaqPCRMasterMix。。,其特征在于使用权利要求1所述的特异性引物PCR扩增待检样品的DNA,如果能够扩增得到679bp的片段,则说明待检样品中含有副溶血性弧菌。,其特征在于所述PCR扩增的反应体系为25μI:,,上游、下游引物各Iμ1,DNA模板1μI;反应程序为:94°C预变性5min,94°C变性30s,59°C退火30s,72°C延伸45s,共30个循环,最后72°C延伸lOmin。