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DNA连接酶(2)(3)基因的结构是相同的载体质粒、动植物病毒、λ噬菌体的衍生物2.(14分)回答利用农杆菌转化法培育转基因植物的相关问题。注:图中箭头所指位置是限制酶识别和切割的位点(1)培育转基因植物过程的核心步骤是构建基因表达载体,其目的是使目的基因在受体细胞中____________,并且可以通过复制遗传给下一代,同时,使目的基因表达和发挥作用。(2)构建基因表达载体时,可利用DNA连接酶连接被限制酶切开的________________键。(3)组成基因表达载体的单体是______________。基因表达载体中的启动子是____________识别和结合的部位,这种结合完成后才能驱动目的基因通过__________(填过程)合成mRNA。(4)用两种限制酶XbaI和SacI(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA,获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体,应选用图中的何种Ti质粒?______________________________________________________。(5)将受体细胞培养成植株需要应用________________技术,该技术的理论依据是__________________。解析:(1)构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以通过复制遗传给下一代,同时,使目的基因表达和发挥作用。(2)DNA连接酶的作用是在DN***段之间形成磷酸二酯键。(3)基因表达载体的本质是DNA,其基本组成单位是脱氧核苷酸;基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,这种结合完成后才能驱动目的基因通过转录合成mRNA。(4)用两种限制酶XbaI和SacI(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA,获得含目的基因的片段。甲、该Ti质粒中含有限制酶XbaI和SacI的切割位点,且用这两种酶切割可将目的基因插入T-DNA中,甲正确;乙、该Ti质粒中不含限制酶SacI的切割位点,乙错误;丙、该Ti质粒中含有限制酶XbaI和SacI的切割位点,但用这两种酶切割不会将目的基因插入T-DNA中,丙错误;丁、该Ti质粒中不含限制酶XbaI的切割位点,丁错误。故选甲。(5)将受体细胞培养成植株需要应用植物组织培养技术,该技术的理论依据是植物细胞的全能性。答案:(1)稳定存在(2)磷酸二酯(3)脱氧核苷酸 RNA聚合酶转录(4)甲(5)植物组织培养植物细胞的全能性3.(14分)内皮素(ET)是一种多肽,主要通过与靶细胞膜上的ET受体(ETA)结合而发挥生物学效应。科研人员通过构建表达载体,实现ETA基因在大肠杆菌细胞中的高效表达,其过程如下图所示,图中SNAP基因是一种荧光蛋白基因,限制酶ApaⅠ的识别序列为,限制酶XhoⅠ的识别序列为。请据图分析回答:(1)进行过程①时,需要加入缓冲液、引物、dNTP和____________酶等。完成过程①②③的目的是____________________。(2)过程③和⑤中,限制酶XhoⅠ切割DNA,使________键断开,形成的黏性末端是__________。(3)构建的重组表达载体,目的基因上游的启动子是___________的部位,进而可驱动基因的转录。除图中已标出的结构外,基因表达载体还应具有的结构是__________。(4)过程⑥要用CaCl2预先处理大肠杆菌,使其成为容易吸收外界DNA的__________细胞。(5)将SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因,其目的是有利于检测____________________________________________________。解析:(1)过程①以mRNA合成目的基因,所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶、ATP和引物等,完成过程①②③的目的是获取目的基因(ETA基因)。(2)过程③和⑤利用限制酶XhoⅠ切割DNA获得目的基因的过程,限制酶使得DNA的磷酸二酯键断开,形成的黏性末端是(3)目的基因上游的启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因的转录,除图示结构外,完整的基因表达载体还应具有复制原点、终止子等结构。(4)过程⑥中,要用CaCl2预先处理大肠杆菌,使其成为处于容易吸收外界DNA的感受态的细胞。(5)利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因,目的是检测ETA基因能否表达及表达量。答案:(1)反转录(逆转录) 获取目的基因(ETA基因)(2)磷酸二酯(3)RNA聚合酶识别和结合终止子(4)感受态(5)ETA基因能否表达及表达量4.(14分)欲增加油菜种子的含油量,研究人员尝试将酶D基因与位于叶绿体膜上的转运肽基因相连,导入油菜细胞并获得了转基因油菜品种。(1)研究人员依据基因的已知序列设计引物,采用________法从陆地棉基因文库中获取酶D基因,从拟南芥基因文库中获取转运肽基因,所含三种限制酶(ClaI、SacI、XbaI)的切点如下图所示。则用________和________酶处理两个基因后,可得到________端与________端(填图中字母)相连的融合基因。(2)将上述融合基因插入右上图所示Ti质粒的T-DNA中,构建________________________并导入农杆菌中。将获得的农杆菌接种在含________的固体平板上培养得到含融合基因的单菌落,再利用液体培养基震荡培养,可以得到用于转化的侵染液。(3)剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间,此过程的目的是________________________________,进一步筛选后获得转基因油菜细胞,该细胞通过________________技术,可培育成转基因油菜植株。(4)用________________法可检测转基因油菜植株中的融合基因是否成功表达。解析:研究人员依据基因的已知序列设计引物,采用PCR方法获取目的基因;用ClaⅠ限制酶和DNA连接酶处理两个基因后,得到A、D端相连的融合基因;将获得的农杆菌接种在含四环素的固体平板上培养得到含融合基因的单菌落,再利用液体培养基震荡培养,可以得到用于转化的侵染液。剪取油菜的叶片放入侵染液中一段时间目的是利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞,获得转基因油菜细胞后,通过植物组织培养技术,可培育成转基因油菜植株。检测转基因油菜植株中的融合基因是否成功表达要看是否表达出相应蛋白质,需要用抗原—抗体杂交。答案:(1)PCR ClaⅠ DNA连接 A D(2)基因表达载体(或“重组质粒”) 四环素(3)利用农杆菌将融合基因导入油菜细胞植物组织培养(4)抗原—抗体杂交5.(14分)棉铃虫是一种危害棉花的害虫。我国科学工作者发现一种生活在棉铃虫消化道内的苏云金芽孢杆菌能分泌一种毒蛋白使棉铃虫致死,而这种毒蛋白对人畜无害。通过基因工程方法,科学家采用花粉管通道法将毒蛋白基因转入棉花植株并成功表达,棉铃虫吃了这种转基因棉花的植株后就会死亡。花粉管通道法是指:利用植物花粉萌发时形成的花粉管通道将毒蛋白基因送入胚囊,进而导入不具备细胞壁的合子或早期胚体细胞,借助天然的种胚系统,形成含有目的基因的种胚。(1)下列所示的黏性末端是由________种限制酶作用产生的。(2)利用花粉管通道法将毒蛋白基因导入棉花细胞,此过程是基因操作的基本步骤中的第三步,即__________________________________________________________________________________。为减少获得目的基因的盲目性,在获得真核生物的目的基因时,应尽量采用________________________________________________________________________________________________________________________的方法。(3)该目的基因在导入受体细胞前需要与载体结合,目前经常使用的载体有________、________和_____________________________。(4)检测该目的基因是否表达的方法是_________________________________________________________________________。解析:用同一种限制酶切出的黏性末端是相同的,图中四个黏性末端各不相同,故为四种限制酶切割而成;获得目的基因的方法有从原有的物种中分离(基因文库中提取)和人工合成目的基因,后者目的性强;载体最常用的是质粒,另外也可以用λ噬菌体的洐生物和动植物病毒等,目的基因是否表达可以在分子水平或个体水平上检测。答案:(1)4 (2)将目的基因导入受体细胞人工合成目的基因(3)质粒λ噬菌体的洐生物动植物病毒(4)让害虫吃棉花,观察害虫的生存状态6.(15分)酵母菌的维生素、蛋白质含量高,可生产食品和药品等。科学家将大麦细胞的LTP1基因导入啤酒酵母菌中,获得的啤酒酵母菌可产生LTP1蛋白,并酿出泡沫丰富的啤酒。基本操作过程如图所示,请据图回答下列问题。(1)该技术定向改变了酵母菌的性状,这种可遗传变异属于________。(2)从大麦细胞中可直接分离获得LTP1基因,还可采用________方法获得目的基因。本操作中为了将LTP1基因导入酵母菌细胞内,所用的载体是________。(3)要使载体与LTP1基因连接,首先应使用______________进行切割。假如载体被切割后,得到的分子末端序列为AATTCG,则能与该载体连接的LTP1基因分子末端是__________。 (4)切割完成后,采用________酶将载体与LTP1基因连接,连接后得到的DNA分子称为________________。(5)此操作中可以分别用含有青霉素、四环素的两种选择培养基进行筛选,则有C进入的酵母菌在选择培养基上的生长情况是_____________________________________________________________________________________________________________。(6)除了看啤酒泡沫丰富与否外,还可用什么方法检测LTP1基因在啤酒酵母菌中是否表达?_______________________________________________________________________________________。解析:基因工程从变异角度分析应属于基因重组,获取目的基因可采用直接从物种中分离或人工合成等方法,常用的载体是质粒。答案:(1)基因重组(2)人工合成质粒(3)限制酶 A (4)DNA连接重组DNA(重组质粒) (5)能在含有青霉素的培养基上存活,但不能在含有四环素的培养基上存活(6)检验转基因啤酒酵母菌能否产生LTP1蛋白7.(15分)我国曾经发生过因“非典型性肺炎”而死亡的病例,经研究发现,该病是由SARS病毒(一种RNA病毒)感染所引起的疾病。SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原,在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗,开展了前期研究工作,其简要的操作流程如图:(1)实验步骤①所代表的反应过程是________。(2)步骤②构建重组表达载体A和重组表达载体B必须使用限制性核酸内切酶和________酶,后者的作用是将用限制性核酸内切酶切割的________和________连接起来。(3)如果省略步骤②而将大量扩增的S蛋白基因直接导入大肠杆菌,一般情况下,不能得到表达的S蛋白,其原因是S蛋白基因在大肠杆菌中不能_______,也不能______________________。(4)为了检验步骤④所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性,可用_________________________________________与___________________________________________________进行抗原—抗体特异性反应实验,从而得出结论。(5)步骤④和⑥的结果相比,原核细胞表达的S蛋白与真核细胞表达的S蛋白的氨基酸序列________(填“相同”或“不同”),根本原因是__________________________________________________________________________________________________________。解析:在解答本题的过程中,应注意分析图中标注过程的含义。①