文档介绍：该【一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法 】是由【421989820】上传分享，文档一共【11】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法本发明提供一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法,主要对真姬菇栽培废料中残留的木聚糖酶进行浸提条件的优化,通过硫酸铵沉淀、透析、SephadexG-100葡聚糖凝胶层析和DEAEC-52离子交换层析等方法对纤维素酶进行分离纯化,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,已达到电泳纯。从金针菇栽培废料浸提液中提取木聚糖酶,对其进行有效的分离纯化,深入地研究木聚糖酶的结构和功能,为木聚糖酶的生产应用提供科学的参考依据。【专利说明】一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法【技术领域】[0001]本发明属于真菌栽培废料生产【技术领域】,具体涉及一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法。【背景技术】[0002]目前,我国食用菌栽培废料资源巨大,长期以来没有得到有效的利用,造成了恶劣的环境影响和有机资源的巨大浪费。食用菌栽培废料中含有大量残余的胞外酶,这些胞外酶具有非常广阔的工业利用价值和应用前景,真姬菇、金针菇是目前工厂化生产主要品种,废菌袋来源稳定,为工厂化提取纤维素酶、木聚糖酶提供了稳定原料来源,通过科学有效的方法利用这些资源,对解决我国能源短缺和环境污染问题具有重要的意义。[0003]金针菇含有木聚糖酶等多种胞外酶,而金针菇是目前工厂化生产主要品种之一,废菌袋来源稳定,为工厂化提取木聚糖酶提供了稳定原料来源。金针菇栽培废料浸提液中残留有木聚糖酶等多种胞外酶,需对其进行有效的分离纯化,才能更深入地研究木聚糖酶的结构和功能,为木聚糖酶的生产应用提供科学的参考依据。[0004]据研究表明,食用菌栽培废料中含有大量残余的胞外酶,这些残留的胞外酶在造纸业、饲料业等工业上有非常广阔的利用价值和应用前景,利用食用菌采收后的废菌袋提取木聚糖酶,在工艺上可节省微生物培养工序,节省酶制剂厂的办厂投入,降低生产成本,拓宽食用菌产业链的延伸,提高生产附加值,变废为宝。如何科学有效地开发利用这些资源,对于解决我国的能源短缺和环境污染及食用菌可持续发展等问题都具有极为重要的意义。【发明内容】[0005]本发明的目的在于提供一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法,从金针菇栽培废料浸提液中提取木聚糖酶等多种胞外酶,对其进行有效的分离纯化,深入地研究木聚糖酶的结构和功能,为木聚糖酶的生产应用提供科学的参考依据。[0006]为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:一种从金针菇栽培废料中分离纯化木聚糖酶的方法,通过硫酸铵沉淀、透析除盐、冷冻干燥、凝胶层析和离子交换层析方法对木聚糖酶进行分离纯化,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,最终获得木聚糖酶。[0007]其具体方法包括以下步骤:(1)粗酶液的制备:金针菇栽培废料粉碎混匀,按1:3加入缓冲液,混匀,室温静置3h;纱布过滤,4°C下lOOOOr/min离心20min,取上清即为粗酶液;(2)硫酸铵沉淀:取粗酶液10mL,20wt.%硫酸铵进行一次硫酸铵沉淀,80wt.%硫酸铵进行二次硫酸铵沉淀,4°C盐析10_15h,4°C,10000r/min离心20min,分别收集上清和沉淀,沉淀用缓冲液溶解至原体积,540nm波长处测定酶活;(3)透析:粗酶液经硫酸铵沉淀后,IOml缓冲液至完全溶解,在同样的缓冲液,4°C,磁力搅拌器上透析;每隔2h更换一次透析液,,检测无白色沉淀产生为止;收集酶液,4°C,lOOOOr/min离心20min,取上清;冷冻干燥,l-2mL缓冲液将可溶蛋白溶解,4°C,lOOOOr/min离心20min,取上清;(4)凝胶层析:缓冲液平衡SephadexG-100葡聚糖凝胶层析,,直至记录仪上的基准线值恒定,停止平衡;取2ml的透析纯化后酶液上柱,用缓冲液洗脱,收集各洗脱峰,检测各管酶活,合并有酶活管,冷冻浓缩;(5)离子交换层析:用Tris-HCl缓冲液平衡DEAEC-52,取2ml用Tris-HCl平衡缓冲液溶解的经S印hadexG-100葡聚糖凝胶层析后的酶液上柱,采用含有NaCl浓度分别为0M、,收集各洗脱峰;检测各洗脱峰的酶活,收集,冷冻干燥;(6)酶纯度的鉴定:分离胶的浓度采用浓度为12%的聚丙烯酰***,-HCl缓冲液,用考马斯亮蓝R-250进行染色。[0008]步骤(1)-(4)中的缓冲液为0·02MρΗ6·0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液;步骤(5)所述的Tris--HCl平衡缓冲液。[0009]本发明的优点在于:(1)对金针菇栽培废料浸提条件进行单因素实验和正交试验,结果表明:、-柠檬酸缓冲液,浸提温度25°C、浸提时间为3h、料液比为lg/3mL。,酶活有了显著的提高,达到了优化的效果。[0010](2)金针燕栽培废料经硫酸铵分级沉淀盐析、透析除盐、SephadexG-100葡聚糖凝胶层析、DEAEC-52离子交换层析分离纯化后,SDS-PAGE鉴定已达到电泳纯。,,%。[0011](3)分离获得的纯化木聚糖酶,。此木聚糖酶的最适反应温度为50°C,温度上升到80°C及以上时,酶活力仍有74%,具有较广的耐高温域。,pH值在3.(,具有较广的酸碱稳定性。[0012](4)不同金属离子对木聚糖酶的影响中,Na+在低浓度下对此木聚糖酶有轻微的促进作用,随着离子浓度的提高,表现出轻微的抑制作用;Fe2+、Zn2+对其具有激活作用;Ca2+、Μη2+、K+对其具有促进作用;Mg2+、Cu2+、Fe3+对其具有强烈抑制作用。[0013](5)以Xylanase作为底物进行此木聚糖酶的动力学研究表明,酶促反应符合米氏方程。^^^;[11,1(1]^/1]11^,￥1]^1/1(1]。说明此底物具有较高的亲和力。【专利附图】【附图说明】[0014]图1木聚糖酶的SephadexG-100葡聚糖凝胶层析色谱图。图中1、2表示色谱峰。[0015]图2木聚糖酶的DEAEC-52阴离子交换层析色谱图。图中1、2、3表示色谱峰。[0016]图3SDS-PAGE电泳图谱,其中M:Marker;I:硫酸铵透析液;II:SephadexG-100凝胶层析浓缩酶液;III:DEAEC-52离子交换层析浓缩酶液。【具体实施方式】[0017](1)浸提液PH值的优化木聚糖酶浸提液pH值的优化,选择pH值在4.(,,共设16个梯度。每组加入相同质量的碾碎后搅拌均匀的栽培废料,分别加入不同PH值浸提液,混匀并常温静置,每个梯度作3个平行。纱布过滤,4°C,10000r/min离心20min,取上清。测定各组浸提液的木聚糖酶活大小,结果表明:,木聚糖酶活逐渐上升,,木聚糖酶活达到最高,。之后,木聚糖酶活随pH值的增大而逐渐减小。,。[0018](2)浸提缓冲液的优化浸提缓冲液选用四组溶液:去离子水、-乙酸钠缓冲液、-柠檬酸钠缓冲液、-柠檬酸缓冲液。用适当的料液比浸泡,混匀,常温静置。纱布过滤,4°C,10000r/min离心20min,取上清,测定各浸提液的木聚糖酶活。结果表明(,浸提缓冲液选用去离子水时,酶活最小,选用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液可达到最大的酶活,说明木聚糖酶在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中具有最高的酶活力,因此采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为金针菇栽培废料中木聚糖酶的最佳浸提缓冲液。[0019]正交试验优化木聚糖酶浸提条件优化的L16(44)正交试验。,结果表明:以测定的木聚糖酶活为指标,浸提温度的极差最大,表明浸提温度对酶活力大小影响最大。各因素对木聚糖酶活的影响程度依次为A(浸提温度)>C(料液比)>B(浸提时间)且A(浸提温度)因素对木聚糖酶活力的影响达到了极显著差异(P〈〇.01)(表3-2)。由此分析,此优化反应的最佳组合为A3B2C2,即浸提温度25°C、浸提时间为3h、料液比为lg/3mL。[0020]按照选取的木聚糖酶浸提条件优化工艺条件(A3B2C2)制备3批样品,,明显优于正交试验的其他组,可以验证正交试验的结果,木聚糖酶活有了显著的提高,达到预期的效果。[0021]硫酸铵沉淀分别取粗酶液10mL,加入硫酸铵至饱和度为20%、25%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%,4°C,盐析;540nm波长处分别测定上清和沉淀的酶活,结果可以看出,硫酸铵浓度在20%时,上清酶活最大,硫酸铵的浓度从25%起,上清酶活逐渐减小,至硫酸铵浓度为80%时,上清酶活最小。硫酸铵浓度在20%时,沉淀酶活最小,硫酸铵的浓度从25%开始,沉淀酶活逐渐增高,至硫酸铵浓度为80%时,沉淀酶活最大。因此采用20%硫酸铵进行一次硫酸铵沉淀,80%硫酸铵进行二次硫酸铵沉淀。[0022]-柠檬酸缓冲液平衡S印hadexG-100,取适量的透析纯化后酶液上柱,用缓冲液洗脱,收集各洗脱峰。结果如图2,有两个洗脱峰,检测各管酶活,发现第二个洗脱峰含有较高木聚糖酶活,将这些管收集冷冻干燥后用于下一步分离纯化。[0023]-52阴离子交换层析缓冲液pH的确定取8支小试管,分别装入DEAEC-52200mg,进行不同的pH值下(、、、、、、、)DEAEC-52阴离子交换层析对木聚糖酶的最佳吸附量实验。每组做三个平行,结果显示,木聚糖酶活随着PH值增大而逐渐增大,。因此,-HCl为DEAEC-52阴离子交换最适层析缓冲液。[0024]-HCl缓冲液平衡DEAEC-52,-HCl平衡缓冲液溶解的经S印hadexG-100葡聚糖凝胶层析后的酶液上柱,采用含有NaCl浓度分别为0M、、、、,收集各洗脱峰。检测洗脱管酶活,不同NaCl浓度的缓冲液进行梯度洗脱,不同的蛋白质组分在不同的阶段被洗脱出来。经检测,含有木聚糖酶活蛋白主要集中在第五个峰,。[0025],采用含有NaCl浓度分别为0M、,对目标蛋白所在的峰(〇.8mol/LNaCl洗脱的蛋白峰)进行分管收集,结果如图2。[0026]检测各管酶活,发现第三个洗脱峰含有较高的木聚糖酶活,将这些管合并为一管,进行冷冻干燥。[0027]木聚糖酶纯度的鉴定将分离纯化后的酶液进行SDS-PAGE电泳,电泳结果见图3。通过SDS-PAGE电泳鉴定,纯化后酶液的蛋白是单一条带,则说明该纯化后的木聚糖酶溶液已达到电泳纯。[0028]6分离纯化结果汇总粗酶液经离心、收集上清、硫酸铵沉淀透析、SephadexG-100葡聚糖凝胶层析、DEAEC-52离子交换层析,各步骤分离纯化结果如表1。[0029]表1木聚糖酶的分离纯化汇总【权利要求】,其特征在于:通过硫酸铵沉淀、透析除盐、冷冻干燥、凝胶层析和离子交换层析方法对木聚糖酶进行分离纯化,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,最终获得木聚糖酶。,其特征在于:其具体方法包括以下步骤:(1)粗酶液的制备:金针菇栽培废料粉碎混匀,按1:3加入缓冲液,混匀,室温静置3h;纱布过滤,4°C下lOOOOr/min离心20min,取上清即为粗酶液;(2)硫酸铵沉淀:取粗酶液10mL,20wt.%硫酸铵进行一次硫酸铵沉淀,80wt.%硫酸铵进行二次硫酸铵沉淀,4°C盐析10_15h,4°C,10000r/min离心20min,分别收集上清和沉淀,沉淀用缓冲液溶解至原体积,540nm波长处测定酶活;(3)透析:粗酶液经硫酸铵沉淀后,IOml缓冲液至完全溶解,在同样的缓冲液,4°C,磁力搅拌器上透析;每隔2h更换一次透析液,,检测无白色沉淀产生为止;收集酶液,4°C,lOOOOr/min离心20min,取上清;冷冻干燥,l-2mL缓冲液将可溶蛋白溶解,4°C,10000r/min离心20min,取上清;(4)凝胶层析:缓冲液平衡SephadexG-100葡聚糖凝胶层析,,直至记录仪上的基准线值恒定,停止平衡;取2ml的透析纯化后酶液上柱,用缓冲液洗脱,收集各洗脱峰,检测各管酶活,合并有酶活管,冷冻浓缩;(5)离子交换层析:用Tris-HCl缓冲液平衡DEAEC-52,取2ml用Tris-HCl平衡缓冲液溶解的经S印hadexG-100葡聚糖凝胶层析后的酶液上柱,采用含有NaCl浓度分别为0M、,收集各洗脱峰;检测各洗脱峰的酶活,收集,冷冻干燥;(6)酶纯度的鉴定:分离胶的浓度采用浓度为