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一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法 1.docx

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一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法 1.docx

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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法专利名称:一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法技术领域:本发明属于植物基因工程技术领域,特别是涉及一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体的遗传转化方法。背景技术:甜高粱是普通高粱的一个变种,生长耗水量仅为玉米的1/3,亩产可高达510吨,其茎秆汁液是发酵制造酒精和培养酵母的理想生物质原料。用甜高粱取代玉米等粮食作物作为原料生产酒精的新工艺,不仅能节约粮食、降低成本,有力地带动发酵产业、振兴酒精生产行业、而且能推进可再生能源事业和畜牧业的发展。发展甜高粱产业关键在于甜高粱新品种的选育与高效栽培。传统育种技术在甜高粱的产量、品质、抗病、抗虫等特性改良方面已发挥了重要作用,但在生产上对品种、品质要求日益提高的情况下,因受现有资源的限制,单靠传统的育种方法难以取得重大突破。利用转基因技术改良高梁品种已引起广泛的关注。植物转基因技术通常依赖于植物快捷、高频率再生体系的建立。然而,甜高粱同普通高粱一样,通过组织培养获得再生植株相对比较困难。目前针对甜高粱组织培养的研究还很少。从甜高粱的成熟胚和未成熟胚诱导愈伤到获得整个再生植株以前虽已有过一些艮道(al.,1986,:349_351;Maetal.,1987,.73389-394;RaoandKaviKishor,1989,:692_693),但遗憾的是能够从外植体诱导胚性愈伤到再生出植株的仅限于个别几个品种(SmithandBhaskaran,1986,Springer-Verlag,NewYork,-223;Raoetal.,1995,-75)。近年来随着人们对甜高粱应用价值的重视,甜高梁组织培养方面的研究也取得了快速的发展。通过对不同基因型品种及外植体、不同培养基成分(包括蔗糖浓度和激素配比等)、不同培养条件对愈伤的诱导、增殖及分化再生能力的影响进行系统研究,为甜高粱品种建立有效的组织培养再生体系提供了参考(Zhaoetal.,2008,-468;Zhaoetal.,2010,(16):2367_2374)。但以上研究大多是以甜高粱的成熟胚和未成熟胚为外植体,目前为止以幼穗为外植体的研究尚很少见有报道。近年来各国科学家正在致力于相关方面的研究,相比其它作物,甜高粱组织培养植株再生困难,而且受基因型的限制,因此甜高粱遗传转化研究进展缓慢,目前尚很少见成功报道。据报道,2009年美国昆士兰大学的研究人员培育出了世界上首例木质素含量降低的转基因甜高粱植株,他们将编码咖啡酰辅酶A-O-oAOMT)和咖啡酸-0-T)的DN***段导入甜高粱品种中,通过改变木质素的含量和组分获得了成功,该项研究成果已申请了专利()。其它研究尚未见相关报道。因此建立甜高粱的遗传转化体系,通过转基因技术培育甜高粱新品种,使其更好地满足实际生产的需求。转化体系的研发将为绿色能源生物燃料和生物材料的开发利用开3辟新的途径。发明内容本发明的目的是提供一种以甜高粱幼穗材料的组织培养再生体系及遗传转化方法和以甜高粱幼穗诱导的愈伤组织的组织培养再生体系及遗传转化方法,以用于甜高粱转基因的研究。—种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体的遗传转化方法,包括如下顺序步骤1)选取幼穗,旗叶期长约2_5cm幼穗,切成薄片;2)将幼穗诱导产生的愈伤组织或幼穗薄片接种于预培养基中培养,所述预培养基为YS-P=MS无机盐+MS有机物+2,4-D2mg/L+++PVP10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+AS(乙酰丁香***)100μmol/L,;所述幼穗诱导产生的胚性愈伤组织为将薄片接种于诱导培养基上诱导愈伤而得到,所述诱导培养基为MS基础培养基+2,4-D2mg/L++PVP10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+,;3)农杆菌介导法转入外源基因;4)接种于共培养基中共培养,所述共培养基YS-C为MS无机盐+MS有机物+2,4-D2mg/L+++PVP500mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+AS100μmol/L,;5)再转入筛选培养基上进行梯度筛选培养,所述筛选培养基为MS无机盐+MS有机物+2,4-D2mg/L+++PVP10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+羧苄青霉素250mg/L+不同浓度的双丙氨膦,;6)将存活的抗性愈伤组织转接于分化培养基中培养至出苗,所述分化培养基为MS无机盐+MS有机物+2,4-D2mg/L++KT2mg/L+PVP10mg/L+羧苄青霉素125mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂,;7)将苗移入生根培养基中培养出根,所述生根培养基为1/2MS基础培养基+肌醇50mg/L++IBA2mg/L+PVP10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L,;8)转移至蛭石培养基上过渡培养1-2周后移栽至温室花盆或大田。所述幼穗长度为2-3cm,薄片约3mm长。所述预培养为26-28°C暗培养3天。所述步骤3)为将预培养的外植体浸泡于农杆菌LBA4404悬浮液(含有携带外源基因的植物表达载体)中15-20分钟,所述农杆菌悬浮液组成为1/2MS无机盐++2,4-++葡萄糖36g/L+AS100μmol/L,。-。所述外源基因为Bt杀虫基因crylAh,所述筛选剂为双丙氨膦。所述共培养为在26_28°C下暗培养3天。所述筛选培养的方法为先在筛选剂浓度为0的筛选培养基上避光恢复培养7天,再转入筛选剂浓度为lmg/L的筛选培养基上,进行一周低压筛选,再转入筛选剂浓度为3mg/L的筛选培养基上,进行一周筛选,之后再转入筛选剂浓度为5mg/L的筛选培养基上,进行一周高压筛选。所述分化培养基中的培养条件为在周期为16小时光照与8小时黑暗循环于26-28°C条件下培养,每7-10天继代培养一次。所述步骤8)转入之前,甜高梁植株苗长约为3_4cm高。4所述步骤9)转入之前,甜高粱植株根长2-3cm。所述甜高粱品种为“BABUSH”和“MN-3025”。本发明通过对植物激素配比、培养基成分、不同基因型等因素对甜高粱组织培养的影响比较发现,,可以大幅度提高诱愈率;同时在培养基中适量添加8-10mg/LPVP和10mg/L抗坏血酸,可以有效地减轻褐化现象,促进诱愈率的提高。本发明建立了甜高粱幼穗愈伤组织培养再生体系,并通过农杆菌介导法成功的将外源基因cryIAh转化幼穗和转化幼穗愈伤组织,得到转基因再生植株,经检测表明,外源基因得到了不同程度的表达,说明本发明的再生体系可用于遗传转化。虽然本发明农杆菌介导法的外植体采用的是幼穗愈伤组织,而没有转化幼穗,但本领域技术人员根据相同的方法及步骤直接转化幼穗,是同样可以实现的。本发明利用甜高梁幼穗为外植体在条件适宜时,能得到较高的愈伤组织诱导率,但是,不同基因型来源的愈伤组织的胚性状况及再生能力差别较大。实验结果表明幼穗是建立甜高梁再生体系比较理想的一种外植体,可以用于进一步的转化研究。甜高粱转基因研究目前尚很少见报道,本发明通过甜高粱农杆菌介导的转化体系的建立,为今后深入开展甜高粱转基因研究奠定了基础。图1用于甜高粱转化的农杆菌p3301UH双元载体T-DNA区结构示意2农杆菌介导转基因甜高粱再生植株的形成过程。(A)-(E)转基因甜高粱幼穗愈伤组织的筛选、植株再生过程(A)农杆菌侵染幼穗愈伤组织用筛选培养(5mg/l双丙氨膦);(B)抗性愈伤组织的分化培养;(C)诱导形成的不定芽;(D)生根后移栽温室;(E)开花授粉结实。图3T0代部分转化植株PCR检测结果。1-11:T0代部分甜高粱转化植株;12未转化植株(CK-);13空白对照(以水为模板PCR产物);14:CK+(以p3301UH为模板PCR产物);15:DNA标准分子量λ/Εοο1301(λ/Ε)(bp):19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925、421。图4部分TO代转化植株RT-PCR结果。M:DNA分子量标准DL2000(bp)100、250、500、750、1000、2000;1,3,5以转化植株cDNA为模板;2,4,6以转化植株总RNA为模板;7以未转化植株cDNA为模板;8=CK+,以P3301UH为模板。图5T0代转化植株双丙氨膦抗性检测。非转基因植株(左边两个叶片),转基因植株(右边两个叶片)。图6T0代转化植株温室玉米螟抗性生测实验。A非转基因植株;B转基因植株。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。下面所涉及的不同基因型的甜高粱均表明来源了,公众可以从申请人的实验免费得到。,用70%酒精进行表面消毒3min,无菌水冲洗多次;在超净台中用刀切成大小均一的薄片接种于诱导培养基[MS基础培养基+2,4-D2mg/L+ZT(玉米素)+PVP(聚乙烯吡咯烷***)10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+,]置于2021°C暗培养34周,使之开始脱分化,形成愈伤组织;之后选择生长迅速、质地松脆、颜色鲜亮的愈伤组织继代培养[诱导培养基+KT(激动素)],每710天继代一次。挑选生长状态良好的愈伤组织接于分化培养基[MS基础培养基+++PVP8-lOmg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+,]上26_28°C光培养23周,之后将愈伤组织再生出的苗移入生根培养基[1/2MS基础培养基+肌醇500mg/L+NAA400mg/L+IBA2mg/L+PVP8-10mg/L+蔗糖30g/L+,]中,当长出根时(苗高34cm,根长23cm),洗去培养基,转移到装有消毒蛭石的小培养钵中炼苗培养7-15天,然后移栽温室或大田。(以幼穗长度为准)接种于幼穗培养基上,其愈伤诱导能力存在差别。,%;,%;,诱愈率达到最高,%。,随着其发育时期的延长,幼穗长度的增加,愈伤组织的诱导率逐渐下降(表1)。本实验结果表明,甜高粱幼穗长度即幼穗在不同发育时期对愈伤组织的诱导具有较大的影响,因此,在以甜高粱幼穗为外植体材料建立组织培养再生体系或遗传转化时,应注意选择适宜的发育时期的幼穗。表1幼穗长度对愈伤组织诱导的影响权利要求一种以甜高粱幼穗或幼穗诱导愈伤组织为外植体的遗传转化方法,包括如下顺序步骤1)选取幼穗,旗叶期长约25cm幼穗,切成薄片,2)将幼穗诱导产生的胚性愈伤组织或幼穗薄片接种于预培养基中培养,所述预培养基为YSPMS无机盐+MS有机物+2,4D2mg/L+++PVP10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+AS100μmol/L,;所述幼穗诱导产生的胚性愈伤组织为将薄片接种于诱导培养基上诱导愈伤而得到,所述诱导培养基为MS基础培养基+2,4D2mg/L++PVP10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+,;3)农杆菌介导法导入外源基因;4)接种于共培养基中共培养,所述共培养基YSC为MS无机盐+MS有机物+2,4D2mg/L+++PVP500mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+AS100μmol/L,;5)再转入筛选培养基上进行梯度筛选培养,所述筛选培养基为MS无机盐+MS有机物+2,4D2mg/L+++PVP10mg/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+羧苄青霉素250mg/L+不同浓度的双丙氨膦,;6)将存活的抗性愈伤组织转接于分化培养基中培养至出苗,所述分化培养基为MS无机盐+MS有机物+2,4D2mg/L++KT2mg/L+PVP10mg/L+羧苄青霉素125mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂,;7)将苗移入生根培养基中培养出根,所述生根培养基为1/2MS基础培养基+肌醇50mg/L++IBA2mg/L+PVP10mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L,;8)转移至蛭石培养基上过渡培养12周后移栽至温室花盆或大田。,所述幼穗长度为2-3cm,薄片约3mm长,所述预培养为26-28°C暗培养3天。,所述步骤3)为将预培养的外植体浸泡于含有携带外源基因的植物表达载体的农杆菌LBA4404悬浮液中15-20分钟。,-,所述农杆菌悬浮液组成为1/2MS无机盐++2,4-++葡萄糖36g/L+AS100μmol/L,。,所述外源基因为Bt杀虫基因crylAh,所述筛选剂为双丙氨膦。,所述共培养为在26-28°C下暗培养3天。,所述筛选培养的方法为先在筛选剂浓度为0的筛选培养基上避光恢复培养7天,再转入筛选剂浓度为lmg/L的筛选培养基上,进行一周低压筛选,再转入筛选剂浓度为3mg/L的筛选培养基上,进行一周筛选,之后再转入筛选剂浓度为5mg/L的筛选培养基上,进行一周高压筛选。