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备YPD平板)。一种高效生产人血小板源性生长因子A剪接体2同源二聚体(PDGF-AA)的方法,主要包括以下步骤1、克隆rhPDGF-A全基因设计一对引物,以人血小板细胞的mRNA为模板,先用RT-PCR扩增总cDNA,再以该cDNA为模板,用PDGF-A特异引物扩增出完整人重组PDGF-A基因片段,PCR条件为95°C预变性,5min,一个热循环;94°C热变性30s,55°C褪火30s,72°C延伸45s,30个热循环;72°C复性lOmin。所获得的扩增片断连接到PMD20-T载体(购自于广州TAKARA公司),用PCR,酶切和核酸测序鉴定,测定序列与Genebank公布的PDGF-A剪接体2的序列一致。PCR扩增引物为上游引物5,-GCCTCGAGAAGAGAAGCATCGAGGAAGCTG-3,()加入了XhoI酶切位点;下游引物5,-GTGTC-3,())加入了XbaI酶切位点。2、构建毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA/PDGF-A1)用XhoI和XbaI双酶切重组质粒rhPDGF-A/pMD20_T,获得目的片断rhPDGF_A,反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司):质粒rhPDGF-A/pMD20-T15μL10XH缓冲液5yLXhoI5UXbaI5U无菌水至50μL2)用XhoI和XbaI双酶切pPICZαΑ,获得载体片断,反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)质粒pPICZαA15μL10XH缓冲液5yLXhoI5UXbaI5U无菌水至50μL3)由1)及2)步后所得目的片断和载体片断,DNA凝胶收回试剂盒回收,该试剂盒购自大连TAKARA公司,具体操作按试剂盒说明书进行。构建示意图见图1。4)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应,目的基因准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内,反应体系如下质粒pPICZα***-A。3、转化重组质粒至毕赤酵母GS-115中将5-10μg经XhoI和XbaI双酶切pPICZαA验证的质粒线性化后(SacI)溶解在10μLMilliQ水中,与80μLGS-115菌感受态混均,;按照Irwitrogen公司操作手册电转化法将重组载体转化到宿主毕赤酵母菌GS-115中。转化后用含有100μg/mLZeocin抗生素的YPD(Yeastextractpeptonedextrose)平板进行筛选,利用PCR对转化子进行了验证(以5’Fac和3’AOXl为引物,PCR电泳结果如图2所示)。