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一种与猪产仔数性状相关的分子标记及其应用的制作方法.docx

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一种与猪产仔数性状相关的分子标记及其应用的制作方法.docx

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文档介绍:该【一种与猪产仔数性状相关的分子标记及其应用的制作方法 】是由【开心果】上传分享,文档一共【10】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【一种与猪产仔数性状相关的分子标记及其应用的制作方法 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种与猪产仔数性状相关的分子标记及其应用的制作方法一种与猪产仔数性状相关的分子标记及其应用的制作方法本发明属于猪分子标记制备与应用【技术领域】,具体涉及一种猪HOXA10基因内含子基因片段作为猪产仔数性状的分子标记。本发明通过制备得到一种与猪产仔数性状相关的分子标记,其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO:1所示,在序列表SEQ?ID?NO:1的第309bp处有一个T/C碱基突变,该突变导致PCR-EciⅠ-RFLP多态性。本发明还公开了该分子标记的制备方法及其在猪产仔数性状关联分析中的应用。本发明为猪产仔数性状标记检测提供了新的标记资源。【专利说明】一种与猪产仔数性状相关的分子标记及其应用【技术领域】[0001]本发明涉及猪分子标记制备【技术领域】,具体涉及一种猪H0XA10基因编码区SNP作为猪产仔数性状相关的分子记及应用,它包括猪H0XA10基因编码区序列突变位点的检测方法与应用。【背景技术】[0002]国民经济的基础在于农业,作为农业基础性产业之一的畜牧业,其发展水平是判断国家和地区农业发达程度的关键指标(李顺,2010)。养猪业是畜牧业的重要组成部分,猪肉需求量在中国肉类制品中位居首位。以往遗传改良的重点为生产性状(指胴体形状和生长性状),随着人们对繁殖性状的日益重视,产仔数作为最重要的繁殖性状正受到越来越多的关注和研究。决定产仔数的关键因素是胚胎成活率,而影响胚胎成活率最关键时期为胚胎附植(着床)时期(Bazeretal.,2009)。同源异形框基因H0XA10是受雌激素(E2)、孕激素(P4)调控并在着床窗口期高表达的转录因子(AchacheandRevel,2006),通过对HOXAl1、EMX2、IGFBPI等靶基因的调控影响胚胎附植过程。对于建立子宫内膜容受性,胚胎定位与黏附的完成等都有着很关键的作用(ModiandGodbole,2009)。[0003]H0XA10是同源框(Homeobox)基因a基因簇中位于胚胎体轴5’端腹部B类基因,在染色体上的位置为7pl5~。H0XA10总长为2691bp的mRNA能够编码785个氨基酸。Satokata小鼠实验表明,H0XA10对建立子宫内膜容受性非常重要。通过总结大量临床案例,Gui等发现,人H0XA10基因表达出现问题会导致子宫内膜异位症进而引起容受性建立失败(Daftaryetal.,2007;Guietal.,1999;Kimetal.,2007;RackowandTaylor,2010;Tayloretal.,1999)。因此H0XA10基因正常表达对于胚胎附植定位阶段的完成有很重要的作用(Wuetal.,2005)0胚泡释放妊娠信号标志着黏附阶段的开始。H0XA10基因在妊娠小鼠子宫内膜基质中表达与胚泡释放妊娠信号同步发生,(Satokataetal.,1995)。两者均能够影响基质细胞的增殖和分化从而影响黏附阶段的进行(Limetal.,1999)0证据显示,抑制H0XA10基因的表达会阻碍小鼠胚泡的黏附(Bagotetal.,2000)。H0XA10基因的正常表达是保证黏附阶段顺利完成的重要影响因子之一。在胚胎附植侵入(蜕膜化)阶段,H0XA10基因在小鼠子宫内膜植入点附近蜕膜间质细胞中高表达,并将这种高表达蔓延至整个蜕膜。这将有助于维持间质细胞对母体分泌的孕激素(P4)的应答反应,防止附植点出血导致的蜕膜化失败(al.,1996;Limetal.,1999)0鉴于H0XA10基因在物种间的高度保守性,因此推测H0XA10基因的表达可能与猪的产仔数性状相关。[0004]大部分繁殖性状的遗传结构是非常复杂的,通过对候选基因多态性的鉴定发现,不同的基因型与生理、免疫、内分泌方面不同的性状相互关联(:Sp?.,2009)0目前,标记辅助选择(MAS)已作为常规选择法的辅助手段而被广泛应用,大大提高了产仔数性状的改良速度。标记辅助选择(MAS)包括随机引物扩增多态性(RAPD)标记、微卫星标记、PCR-RFLP标记、分子标记与QTL位点的连锁分析方法等(赵西彪,2008)。其中PCR-RFLP因检测不受发育阶段、性别等外部条件的影响,所标记的变异数目不受限制,实用可靠而得到广泛的应用。【发明内容】[0005]本发明的目的在于获得一种与猪产仔数性状相关的分子标记,克隆H0XA10基因编码区序列,寻找突变位点以及基因多态性的检测方法,为猪产仔数性状检测提供一种分子标记和方法。[0006]本发明的技术方案如下:[0007]本发明获得了一种与猪产仔数性状相关的分子标记,它包含猪(国外血缘猪大白猪和中国地方猪血缘猪陆川猪、隆林猪等)H0XA10基因404bp的序列(其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1或图4所示);通过上述序列进行ClusterW比对提供了位于该扩增片段中的309bp处的T/C碱基变异(等位基因突变),导致PCR-Eci1-RFLP多态性,其多态性检测结果如图1所示。[0008]一种扩增猪(大白猪、陆川猪、隆林猪)H0XA10基因目的片段的引物,其DNA序列如序列表SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示。[0009]申请人:提供了一种筛选与猪产仔数性状相关的分子标记的方法,按照以下步骤:[0010]选择三个猪品种(国外血缘猪代表品种大白猪、中国地方血缘猪代表品种陆川猪和隆林猪)为实验材料,从猪耳缘组织中提取DNA;根据猪H0XA10基因组序列设计引物(序列见SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示)并分段扩增;对PCR产物进行序列测定,进而进行序列比对,筛查SNP,然后再利用SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的序列进行片段扩增,将PCR扩增片段进行EciI酶切分型及检测。[0011]本发明提供了鉴定上述序列309bp处T/C变异的Eci1-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法。[0012]进一步本发明提供了利用Eci1-RFLP方法确定的不同基因型个体与产仔数性状间的关联分析。[0013]更详细的发明方案见《【具体实施方式】》所述。【专利附图】【附图说明】[0014]序列表SEQIDN0:1是本发明扩增的国外血缘猪种大白猪和中国地方猪种陆川猪、隆林猪的核苷酸序列,序列长度为404bp。[0015]序列表SEQIDNO:2是本发明制备SEQIDNO:1特异基因片段所用的正向引物,也是实施猪T/C变异Eci1-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物;[0016]序列表SEQIDNO:3是制备SEQIDNO:1特异基因片段所用的反向引物,也是实施猪T/C变异Eci1-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的反向引物。[0017]图1:为本发明三个猪种H0XA10基因序列测序结果和SNP位点;[0018]图2:为本发明猪H0XA10基因扩增所得目的片段的琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为2%,图中标记M泳道为DNAMarkerDL2000,泳道I为序列表SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示引物在不同猪种中的扩增片段,片段大小为404bp;[0019]图3:为猪H0XA10基因Eci1-RFLP检测结果。琼脂糖凝胶浓度为3%,基因型片段大小分别为294bp、94bp和16bp,TT基因型片段大小分别为388bp、16bp,而杂合基因型TC片段大小分别388bp、294bp、94bp和16bp。[0020]图4:为本发明扩增的猪的核苷酸序列,在该序列的309bp处存在一个等位基因突变(该序列中第309bp处的R是T或C)。【具体实施方式】[0021]实施例1:基因片段的获得及多态性检测方法的建立[0022]猪H0XA10基因序列扩增[0023](I)采集耳组织样[0024]选择一个国外血缘猪种(大白猪)和两个地方血缘猪种(陆川猪、隆林猪,来自翔猪基因公司西江泰和猪场)为试验材料,采取猪的耳缘组织;[0025](2)基因组DNA提取[0026]从猪的耳缘组织中提取猪的基因组DNA,DNA样品全部采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒(TIANampGenomicDNAKit)(按该试剂盒说明书进行操作)提取。[0027]⑶引物设计[0028]根据猪H0XA10基因(GenBank基因登录号为JN_836600)突变位点附近序列,设计一对特异引物。其中[0029]正向引物为H0XA10-F1(5,-GCTCTGGGAGGCAAGCGCAATG-3’),[0030]反向引物为H0XA10-R(5,-GGGCACA-3’);[0031](4)聚合酶链式反应[0032]用此引物利用PCR法,以抽提的大白猪、陆川猪和隆林猪基因组DNA为模板,进行PCR扩增。PCR反应体系:,dnTP(),上述制备的正向引物(IOuM),上述制备的反向引物(IOuM),DNA模板(50ng/ul)Iul,,;PCR扩增程序:94°C预变性lmin,94°C变性30s,60°C退火30s,72°C延伸30s(步骤2-4循环30次),72°C延伸10min,4°C保存。对长度为404bp的PCR产物进行序列测定,得到如SEQIDN0:1所述的核苷酸序列。将不同猪种的PCR产物序列测序峰图结果见图1。位于该片段的309bp处的T/C变异引起了EciI酶切位点(GGCGGA(N)11’)多态性。[0033](5)限制性内切酶酶切反应,多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测[0034]采用Eci1-RFLP方法对猪H0XA10基因SNP进行基因分型,酶切反应条件:PCR产物6ul,10XCutSmartBufferIul,EciI(2U/ul),,37°C酶切lh。取5ul酶切产物在3%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测,之后进行基因型分析和鉴定。此扩增片段大小为404bp,EciI酶切多态性位点位于该片段的309bp处,当该处变异位点为C碱基时,会产生限制性内切酶EciI的酶切位点(GGCGGA(N)11'),由于在扩增片段16p存在另外一个EciI酶切位点,所以EciI消化PCR产物后会产生3个片段(294bp、94bp和16bp),;当该处变异位点为T碱基时,则不存在EciI酶切位点,EciI消化PCR产物后会产生2个片段(388bp和16bp),基因型为TT;当该处变异位点为T/C杂合基因型时,EciI消化PCR产物后会产生4个片段(388bp、294bp、94bp和16bp),基因型为TC。[0035]实施例2:本发明制备的分子标记在不同猪群中的多态性分布检测[0036]采用PCR-RFLP的方法对PCR-Eci1-RFLP多态性位点在国内外7个品种共442头猪中的基因型与等位基因频率分布情况进行了检测,其结果见表1。其包括中国地方猪种陆川猪、隆林猪、恩施黑猪、梅山猪和通城猪,国外猪种包括大白猪与杜洛克猪。检测结果表明,在大白群体中TC型分布较多,TT型分布较少,C基因频率略高于T基因频率;型分布较广,TC型很少(只有I个),优势等位基因为C;型分布较广,没有TC、TT基因型,优势等位基因为C;型分布较广,TT型分布很少(只有I个),优势等位基因为C;、TC型分布较多,没有TT基因型,C基因频率高于T基因频率;型分布较多,TT型分布较少,C基因频率高于T基因频率;型分布较广,TC型很少(只有I个),没有TT基因型,优势等位等位基因为C。[0037]表1H0XA10基因的基因型频率和基因频率[0038]【权利要求】,其核苷酸序列如下所示:T上述序列中的第309bp处的R是T或C,该突变导致PCR-Eci1-RFLP多态性。,其DNA序列如下所示:正向引物:GCTCTGGGAGGCAAGCGCAATG,反向引物:GGGCACA。,其特征在于以下步骤:从大白猪、陆川猪、隆林猪耳缘组织中提取基因组DNA,在位于猪HOXAlO基因突变位点附近设计一对引物,该引物的DNA序列如序列表SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示,对猪基因组DNA进行PCR扩增和序列测定,得到如序列表SEQIDNO:1所示的基因片段,通过序列比对,筛查SNP,再利用SEQIDN0:2和SEQIDNO:3所示的引物对进行PCR扩增,将PCR扩增获得的片段进行EciI酶切分型及检测。。。