文档介绍：该【高耐受草甘膦的epsp合酶及其编码序列的制作方法 】是由【开心果】上传分享，文档一共【18】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【高耐受草甘膦的epsp合酶及其编码序列的制作方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。高耐受草甘膦的epsp合酶及其编码序列的制作方法专利名称::高耐受草甘膦的epsp合酶及其编码序列的制作方法技术领域::本发明涉及一种新型高耐受草甘膦的EPSP合酶(5-烯醇式***莽草酸-3-磷酸合酶),以及编码该合酶的核苷酸序列。背景技术::草甘膦(glyphosate)为Monsanto公司产品1^皿(1叩中的主要活性成分,该除草剂是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂,是全世界使用量最大的除草剂品种之一。但是,该除草剂也是一种非选择性除草剂,对农作物同样有着杀死作用。为在农业生产中使用草甘膦,须培育出具有草甘膦抗性或降解性质农作物。草甘膦抑制植物莽草酸代谢过程中5-烯醇式***莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)活性,进而阻断芳香族氨基酸的生物合成而使植物死亡(.,in〃e/^'w'ofe-力邵ects,,Ed.(CRCPress,BocaRaton,FL,1996),-84),当前全球商业化种植的所有草甘膦抗性转基因作物均为针对EPSP所设计,是目前商业化转基因抗草甘膦作物的唯一作用机制。应用化学诱变细菌产生的aroA突变体,抗药性机理研究确证了aroA基因是草甘膦作用靶标EPSP合酶的编码基因。美国Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的编码基因aroA及其抗草甘膦转基因植物等方面已申请了100余份专利,获得转基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等作物系列品种,其中大豆等多种转基因作物己进入商品化生产。目前尚未见到在核苷酸水平与已报道的EPSP合酶编码基因(3roA)同源性较低的抗草甘膦的EPSP合酶。发明内容本发明的目的是发i见并人工合成新型高耐受草甘膦的EPSP合酶以及编码该合酶的核苷酸序列,并将该序列转入植物中,培育新型的高耐受草甘膦的转基因植物。本发明首次发现了一种新型高耐受草甘膦的EPSP合酶,如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列,以及编码该合酶的核苷酸序列,如SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示。经序列结构分析和序列比较分析(见图3),显示该EPSP合酶属于I型EPSP合酶。本发明采集草甘膦极端污染环境中土壤样品,用免培养方法从中分离群落水平总DNA,构建群落水平总DNA粘粒文库,并筛选草甘膦抗性转化子;将转化子点于含20mM草甘膦的M9固体培养基上筛选抗性转化子。本发明还进行了草甘膦耐受实验,结果表明上述转化子具有非常强的草甘膦耐受活性。本发明还进行了高耐受草甘膦的DN***段的全核苷酸序列测定。分析结果表明,插入的片段大小为3151bp,其中包含了一个1335bp的阅读框,其序列如SEQIDNO:2所示,它包含的核苷酸序列全长为1335个碱基,其开放读框位于885-2220位,编码全长为445个氨基酸的EPSP合酶(如SEQIDNO:l所示)。本发明对上述高耐受草甘膦的EPSP合酶基因进行了人工合成,其序列如SEQIDNO:3所示。将人工合成的5'和3'端酶切位点为SflwHI和7//mffll位点EPSP基因,用于表达高耐受草甘膦的EPSP合酶以及构建相应的基因植物表达载体。将上述人工合成的EPSP基因,用BawHI和历'"dIII酶切后,连入相同酶切的载体pET28a得到重组质粒pETGR-79并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)(Promega公司)。本发明还进行了EPSP的酶活测定和动力学参数的测定,。Kj/。根据动力学参数可知,GR-79EPSP不仅具有较高的草甘膦抗性,而且还保持着与PEP较强的亲和性,这些特性将为用于转基因作物的培育提供可能。本发明构建了高耐受草甘膦的EPSP合酶基因植物表达载体,利用叶盘法转化构建抗草甘膦的转基因烟草,经草甘膦抗性梯度实验证明,转基因植物能在含20mM草甘膦的培养基上良好生长。本发明还提供了一种重组载体,它包含SEQIDNO:2所述的DNA。本发明用上述重组载体转化宿主细胞,这些宿主包括原核细胞,也包括真核细胞。本发明还提供了一种利用转基因技术将SEQIDNO:2转化入植物的方法,以提高植物对草甘膦抗性,其步骤如下(1)将SEQIDNO:l或SEQIDNO:2所示序列可操作地连于植物表达调控序列,形成植物表达载体;(2)将步骤(1)中的表达载体转入植物细胞;(3)经筛选获得转化细胞并最终再生转基因植株及其后代,包括植物种子及植物组织。上述"可操作地连于"表示如下情况即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如,如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌,那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA;如果启动子控制序列的转录,那么它是可操作地连于编码序列;如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时,那么它是可操作地连于编码序列。一般,"可操作地连于"意味着相邻,而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。上述载体可选用本领域已知的各种载体,如市售的载体,包括质粒,粘粒等。在本发明中,EPSP合酶编码基因指编码具有SEQIDNO:l蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性,所以与SEQIDNO:2同源性低至约89%的简并序列也能编码出SEQIDN0:2所述的序列。该术语还包括能在中度严谨条件下,更佳的在高度严谨条件下与SEQIDNO:2核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQIDNO:2中的核苷酸序列的同源性至少89%,较佳地至少80%,更佳地至少卯%,最佳地至少95%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的SEQIDNO:l相同功能的蛋白的SEQIDNO:2中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个,较佳地l-60个,更佳地l-20个,最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代,以及在5,和/或3,端添加数个(通常为60个以内,较佳地为30个以内,更佳地为10个以内,最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中,SEQIDNO:l蛋白还包括具有与SEQIDNO:l的相同功能的变异形式。这些变异形式包括但并不限于若干个(通常为l-50个,较佳地l-30个,更佳地卜20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在所述蛋白中,用性能相近或相似的氦基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SEQIDNO:l蛋白的活性片段和活性衍生物。所述多肽的变异形式包括同源序列、EPSP合酶保守性变异多肽、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与SEQIDNO:2杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用SEQIDNO:l多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。上述"EPSP合酶保守性变异多肽"指与SEQIDNO:l的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽可以根据表l进行氨基酸替换而产生。表1氨基酸替换表tableseeoriginaldocumentpage6图1是GR-79克隆草甘膦抗性分析图,图中GR-79-ER菌株是土壤总DNA部分酶切后与载体pACYC184连接后转化入EPSP合酶缺陷型大肠杆菌ER2799菌株(NEB公司)后获得的草甘膦抗性菌株。CP4-ER菌株是将来源于取cp4的EPSP合酶基因与载体pACYC184连接后转化入EPSP合酶缺陷型大肠杆菌ER2799菌株(NEB公司)后获得的草甘膦抗性菌株。本图中作为阳性对照。pACYC184-ER是含有pACYC184质粒(NEB公司)的EPSP合酶缺陷型大肠杆菌ER2799菌株。本实验中作为阴性对照。本图是将三株菌株分别接入到含有O,20,50,80,100,120,150,200,250,300mM草甘膦浓度的限制性培养基M9中,经过37'C、36h的摇床培养后,测定菌液在OD600时的吸光度值,所绘制而成。图中可见菌株GR-79-ER在含有250mM浓度的草甘膦的限制性培养基中能够生长,说明该菌株草甘膦抗性能达250mM。说明质粒上携带的外源片段能够对缺陷型菌株ER2799进行功能互补。而阴性对照菌株不能在限制性培养基中生长,不能对缺陷型菌株进行功能互补。阳性对照菌株草甘膦抗性达200mM。图2是GR-79的EPSP合酶在不同时间的蛋白表达。GR-79菌株中的EPSP合酶基因与pET28a载体连接后转入BL21中,在IPTG的诱导下进行蛋白表达,取样时间分别间隔一小时。样品经过煮沸后经SDS-PAGE电泳分离。结果显示该菌株在4小时的蛋白表达量就已经达较高程度。表达的蛋白为可溶性蛋白。大小约45kD。图3是GR-79氨基酸序列与报道的ClassI和ClassII典型类型的氨基酸序列的比较。比较结果显示GR-79的氨基酸序列属于ClassI类型的EPSP合酶。并且GR-79的EPSP合酶是一种具有草甘膦抗性的I型酶。具体实施例方式下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于举例说明本发明的方法,而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的,均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。实施例l高耐受草甘膦的DN***段克隆1、草甘膦极端污染环境中土壤样品的采集从被50%左右草甘膦污染达十年以上的土壤中(河北某化工有限公司草甘膦生产工厂开放式分装点)采集土壤样品。2、采用免培养方法从草甘膦极端污染土壤样品中分离群落水平总DNA称取草甘膦污染土壤样品2克,(),4000转/分振荡2次。加入300u12%SDS+12%苯酚Tris缓冲液()溶液冰上1小时,加入等量苯酚Tris缓冲液,(约700ml),充分混匀,经4°C,13,OOO卬m离心5分钟。,。DNA沉淀溶于200u1lxTE(粗DNA)。称100mg***,加入100U1粗DNA轻轻混匀,室温黑暗条件下静置1-3小时。室温,13,OOOrpm,离心20分钟。上清液中加入400ul无菌去离子水和300ul异丙醇,室温静置30分钟。室温,13,OOOrpm,离心20分钟。沉淀溶于100lUlxTE和40ul8M醋酸钾(KAc),室温静置15分钟。4'C,13,OOOrpm离心15分钟。。室温静置30分钟。室温,15,OOOrpm离心20分钟。DNA沉淀溶于100U1lxTE。采用Wizardspincolumnclean-up分离试剂盒纯化DNA样品。纯化DNA溶于总体积为lOOul的lOmMTris-EDTA()缓冲液中。3、群落水平总DNA粘粒文库的构建土壤细菌DNA用Sfl"3AI在lOul反应体系进行部分酶切试切,Sflw3AI酶按1:100稀释,37°C,分别酶切10min,20min,30min,40min,50min,60min后加入10Xloadingbuffer1P1终止反应,电泳检测最适酶切反应时间。而后选择相同的体系酶切30min进行大量酶切。经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收26kbDN***段备用。质粒载体pACYC184(NEB公司)用SamHI完全酶切后用SAP碱性磷酸脂酶进行末端去磷酸化,以减少载体自连。上述回收后的土壤细菌DNA(200ng)和末端去磷酸化的质粒载体pACYC184(150ng)用2U的T4ligase在4。C下连接16h。(NEB公司)电击感受态细胞,涂布LB+Cmr。然后将LB板上生长的克隆影印到M9+Cmr+50mM草甘膦的平板,37。C培养48h。将平板上生长的菌经LB平板划线培养后,将这些菌落再接种到含不同草甘膦浓度的M9平板上(100,150mM草甘膦)。将这些重组菌中的质粒抽提后重新转化ER2799后涂布M9+Cmr平板验证(ER2799+pACYC184为对照),同时进行重组质粒酶切验证。4、筛选草甘膦抗性转化子将转染细菌涂布含Cm(***霉素)、的LB平板上,37。C培养20h后,约有5000个菌落生长,将这些菌落影印到含Cmr和50mM草甘膦的M9平板上培养48h后,有三个菌落生长。将这三个菌落接种到含100mM、150mM的草甘膦的M9平板上培养,发现只有1个克隆能在含150mM的草甘膦的M9平板上生长,其所含的质粒被命名为pACYCGR-79。从该克隆抽提的质粒pACYCGR-79转入大肠杆菌ER2799(NEB公司)或大肠杆菌JM1098(Promega公司)中,将转化子用无菌牙签点于含20mM草甘膦的M9固体培养基上检验抗性,结果证明这个克隆所产生的转化子均具有抗草甘膦特性,表明抗草甘膦特性确实是由于转入pACYCGR-79引起的。5、草甘膦耐受实验将大肠杆菌ER2799(含携带有新克隆的pACYCGR-79质粒)接种到含0200mm草甘膦的M9液体培养基(Cmr)中,经过37'C、36h的摇床培养后,测定培养物的OD600。同时以无插入片段的质粒的大肠杆菌ER2799为阴性对照。结果将ER2799(携带pACYCGR-79质粒)接种到含0300mM草甘膦的M9液体培养基(Cmr)中,经过37'C、36h的摇床培养后,发现阴性对照在M9中几乎不能生长;而ER2799(pACYCGR-79)在含有250mM草甘膦的M9液体培养基中还能生长(见图1)。这一结果说明pACYCGR-79上携带的外源片段具有非常强的草甘膦耐受活性。而带有CP4质粒阳性对照菌只能在200mM的液体培养基中生长。实施例2高耐受草甘膦的DN***段的序列分析及其EPSP合酶功能验证1、高耐受草甘膦的DN***段的序列分析对实施例1中所亚克隆的高耐受草甘膦DN***段进行全核苷酸序列测定。分析结果表明,插入的片段大小为3151bp,其中包含了一个1335bp的阅读框,其序列如序列1所示,它包含的多核苷酸序列全长为1335个碱基,其开放读框位于885-2220位,编码全长为445个氨基酸的EPSP合酶。将所亚克隆的高耐受草甘膦编码序列与已报道的EPSP合酶编码基因(woA)比较,在核苷酸水平同源性较低。氨基酸序列同源性分析结果表明,GR-79氨基酸序列与已报道的典型的I型EPSP合酶的氨基酸同源率均高于该酶与II型EPSP合酶的氨基酸序列的同源率,并且GR79氨基酸序列中不含有n型酶中典型的保守氨基酸区段,而含有的保守氨基酸区段类似于I型酶。说明GR-79EPSP属于I类EPSP。GR-79EPSP与典型的I型和II型EPSP合酶的系统发育比较结果,如图3所示。实施例3高耐受草甘膦的EPSP合酶基因的人工合成根据已完成的含1335bp编码区的核苷酸序列,首先分8个区段分别根据正链和副链序列,分别合成出长度约150-200bp、具有粘性末端的单链寡核苷酸片段。将正链和副链各一一对应的8个互补的单链寡核苷酸片段分别退火,形成8个带有粘性末端的双链寡核苷酸片段。混合双链寡核苷酸片段,经T4DNA连接酶催化组装成一个完整的EPSP合酶基因。该合成的DN***段含有SEQIDNO:2中1-335