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靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体的制作方法 1.docx

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靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体的制作方法 1.docx

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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体的制作方法专利名称:靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体的制作方法技术领域:本发明利用油体膜蛋白连接Zhot2肽,而组装成OleZH2蛋白质,此OleZH2蛋白质能包覆脂质、脂溶性药物或是已知荧光信号分子成为OleZH2油体,再将OleZH2油体应用于靶向治疗或检测的应用;本发明利用油体膜蛋白连接一个专一性接头(linker)连接Zlte2肽,通过分离便可以纯化Zlto2蛋白,并得到纯度高的OleZH2油体;本发明利用外切酶肽或内切酶肽连接油体膜蛋白连接Zlto2肽再连接外切酶肽或内切酶肽,而组装成OleZH2油体,该OleZH2油体能检测癌变部位,并进入过表达的癌细胞使细胞分裂或是自我凋亡。背景技术:根据统计,癌症是全世界死亡率最高的疾病之一,癌症,也称为恶性肿瘤,定义为有不明原因抑或是由多重病因所引起,而发生在人类身上的恶性肿瘤。癌症可生长在身体任何组织和器官内,并且有分化潜能、无法控制生长和转移的细胞的能力,使得细胞无法正常调节控制生长,导致生理功能异常,且无法正常治愈。对女性而言,乳癌和子宫颈癌的致死率的名列前茅。传统的癌症治疗方法大致分成下列几种,即外科手术疗法、放射疗法、化学疗法及免疫(基因)疗法。外科手术疗法主要可以直接、快速地移除恶性肿瘤,是最古老、传统且最常用的癌症治疗方式,对于肿瘤生长在身体局部一处时,直接切除方式有很好的治疗效果。若癌细胞扩散,外科手术后遗症是常需要切除肿瘤邻近组织及淋巴组织,常常因为切除过多的组织会造成病人局部功能缺损、障碍,还有手术猝死或弓I起并发症而致死等。放射疗法又称电疗,主要是使用放射线破坏癌细胞,针对癌细胞的方法有两种外在放射疗法及内在放射疗法。外在放射疗法是利用仪器将X光或Y射线释放于肿瘤上而杀死癌细胞。内在放射疗法是将放射物质以颗粒或胶囊方式置入癌症病人体内,对于不适合开刀或不宜切除的组织治疗常会选用此种放射疗法,有时放射疗法也会和外科疗法或化学疗法合并使用,此种方法的后遗症是恶心、呕吐、咳嗽或呼吸困难、吞咽困难、疲倦、掉头发和引发内脏破裂等。化学疗法化学疗法是利用化学物质或激素杀死癌细胞,此方法可以通过口服或注射方式进行治疗,化学疗法可广泛使用在各式肿瘤上。对难以控制及大范围转移或全身性的癌细胞杀死,化学疗法是唯一的、最后的选择,后遗症是全身细胞受到破坏,特别是对免疫淋巴球,治疗时间长,会引起全身细胞的抗药性。免疫疗法免疫疗法是利用病人身体不同的免疫机制备用物质如白介素、肿瘤坏死因子、单克隆抗体及疫苗等来对抗、破坏癌细胞的快速生长。免疫疗法也可以和上述三种常用的癌症治疗方法合并使用并能大幅降低副作用如疲倦、食欲不振、掉发、口腔或皮肤溃烂、恶心及牙齿掉落等大幅降低,并且可在治疗间隔期协助正常细胞慢慢修复,缓慢提升免疫力,并提升癌症的治疗效果,但是治疗时间长,效果也很有限。经过长时间的观察发现,癌细胞表面通常会带有某些特殊分子生物标记在于之前描述特性,这些年来已经发展出靶向治疗方法用于癌症的治疗。靶向治疗方法就是利用实验设计一种可以专一性地识别此类生物标记的药物方法,靶向治疗方法可以有效地阻断癌细胞的活化并且能使癌细胞生长受到抑制,而达到治疗目的。靶向治疗药物可以直接且精准地命中目标癌细胞,抑制癌细胞,对体内正常细胞的影响较小,相比于上述治疗方法,靶向治疗具有低毒性、低副作用、高效率、及施行方便等优点,已经引起大家的关注。目前靶向治疗的方法甚多,其一是利用载体组装、包覆、连结或镶嵌而成的治疗活性的药物分子,并运用各种机制将具有专一性的活性药物分子递送到目标癌细胞进行作用,此种递送体系称为“药物递送体系”。通常会将载体与可专一性地识别癌细胞表面生物标记的物质结合,而使此载体具有靶向功能,所述物质可为蛋白质、类固醇、糖类、化合物或抗体等。载体目前有高分子聚合物颗粒、微胞(micell)、脂质体、及病毒载体等,这些载体也存在不同缺点,如载体粒径过大而不容易被人体吸收、载体容易聚集而不容易被人体吸收、具有毒性而无法排出体外、在血液或体液中不会稳定存在等,在实际运用中也很有限。而且在上述可识别癌细胞的物质与载体结合时,常常需要非常复杂耗时的化学合成步骤,往往会增加制造成本,更会对环境造成污染。所以,在药物递送体系中,也需要非常大的改良空间并改善成粒径微小、无毒性、在血液或体液中稳定、容易结合可识别癌细胞的药物载体体系。本发明是利用油体作为载体并连接目标蛋白而组装形成OleZH2油体,本发明试图利用OleZH2油体包覆脂溶性药物(以下简称为包覆药物)而组成靶向人造纳米油体药物递送体系。本发明经过活体内(invivo)及活体外(invitro)的相关实验确认此体系毒性低、副作用低、效率高、稳定、制备过程方便及对环境造成污染甚低或是可以忽略。本发明利用靶向人造纳米油体药物递送体系,可以有效地运用在靶向治疗或是癌症检测上,且具有高度的专一性。本发明是由不同可以合成出药物的类似物的肽或是对病症有治疗效果的肽(上述肽简称药物肽),经过基因工程组成药物或是对病症有治疗效的合成物或合成多蛋白,并连接上油体蛋在接上Zlto2肽,该油体可以包覆已知荧光信号分子并组装成自组装靶向药物蛋白,此蛋白能够专一性地识别癌化部位并能自行组装药物蛋白进行癌化部位检测、抑制及药物治疗。纯化方式非常多,如沉淀法、分子筛色层分析法、电泳、亲和层析法和共价层析是已知技术且用于细胞提取物中纯化蛋白质。而且需要表达有关蛋白酶抑制剂当作一种融合蛋白或嵌合蛋白。融合蛋白技术经常用在蛋白质的纯化过程中,提供一种"标记"或"操作"。一般而言,以这些体系表达的融合蛋白里面包含亲和标记,例如谷胱甘肽S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、纤维素结合结构域、聚组氨酸、聚半胱氨酸,蛋白A及链霉亲和素等等,所述标记共价结合于OleZH2蛋白质的N-端或C-端。为方便亲和纯化,对此标记具有专一性的配体被固定于一个管柱的固态相上。融合蛋白结合至亲和柱,需要加入过量调整缓冲液(pH值)而冲提出高纯度的融合蛋白。OleZH2蛋白从标记分子上的分离,以蛋白水解切割于其专一性接头序列。在所使用亲和柱的准备与操作上,虽然比较简便,但是价格非常昂贵,不符合经济效益。抗体固定化免疫亲和技术是利用一种表达的融合蛋白的结合方式,里面含有抗原性的寡肽标记,该标记有运用抗原性前端(antigenichead)部分及连接尾端(linkingtail)部分。该抗原性部分组成是用一些可以快速引发抗原性反应的亲水性氨基酸。而连接区域可以标记在融合蛋白,从细胞分离后再融合蛋白上被切割,而得到该蛋白。使用抗体固定化免疫亲和技术对于纯化技术也很有限。本发明是利用AOB系统进行纯化,能更快速且更经济地得到融合蛋白。利用OleZH2有专一性接头的油体,再利用专一性蛋白酶水解切割专一性接头,可纯化出纯度高的Zlte2蛋白质。发明内容本发明提供一种融合蛋白质(下文简称为OleZH2蛋白质),此蛋白包含Zlte2肽与油体膜蛋白的组合。本发明也提供一种油体膜蛋白载体,其包含油体膜蛋白结合Zlte2肽及任何油脂,而形成专一性的纳米油体,其中该OleZH2蛋白质与该脂质的重量/体积比值(微克/微升)为至少约1/25,且该OleZH2油体的平均粒径为纳米等级。本发明又利用OleZH2蛋白质包覆已知荧光分子,可以用于识别专一性癌细胞的检测使用。本发明又利用OleZH2蛋白质包覆药物,可以用于识别专一性癌细胞的靶向治疗使用。本发明又利用OleZH2蛋白质包覆已知荧光分子和包覆药物,可以用于识别专一性癌细胞的检测及祀向治疗使用。本发明又利用类似OleZH2药物油体,可以用于识别专一性癌细胞的靶向治疗使用。本发明又利用OleZH2有专一'丨生接头的油体,再利用专一丨丨生蛋白酶水解切割专一丨I"生接头,可纯化出纯度高的Zlte2蛋白质的应用。图I、油体的构造。图2、OleZH2油体的制备过程。图3、Zaer2蛋白纯化制备过程。图4、OleZH2药物油体的制备过程。图5、OleZH2蛋白质组成及自主装OleZH2油体实验观察。图6、OleZH2油体包覆GGK黄和尼罗红的油体显荧光微镜观察。图7、OleZH2油体进行原子力显微镜测试。图8、OleZH2油体的不同条件组成进行荧光显微镜观察(图示标尺为2微米)。、图9、OleZH2油体的不同条件组成进行稳定度测试。图10、OleZH2油体的不同条件组成进行粒径测试。图11、OleZH2油体对细胞的体外测试荧光显微镜观察_(固定)细胞。图12、OleZH2油体对细胞的体外测试荧光显微镜观察_(活)。图13、OleZH2油体对SK0V3细胞测试荧光显微镜观察-不同(浓度)。图14、OleZH2油体对SK0V3细胞测试荧光显微镜观察-不同(时间)。图15、OleZH2油体作用细胞进行流式细胞仪测试-不同(浓度)。图16、OleZH2油体作用细胞进行流式细胞仪测试-不同(时间)。图17、OleZH2油体作用SK0V3细胞利用共轭荧光显微镜XY轴平面观察及Z轴切面观察。图18、OleZH2油体包覆药物的稳定度实验。图19、oleZH2油体包覆不同浓度喜树碱的毒性实验细胞计数(第72小时)_茄红素、姜黄素和喜树碱。图20、OleZH2油体包覆喜树碱药物在细胞毒杀实验(4天)。图21、OleZH2油体包覆药物对血球血溶性实验-茄红素、姜黄素和喜树碱。图22、OleZH2油体进行油体融血实验(血球)。图23、OleZH2油体在血清随时间粒径变化测试。图24、OleZH2油体在小鼠体内肿瘤注射后随不同时间IVSI观察测试。图25、OleZH2油体在小鼠注射24小时后脏器随不同时间IVSI观察测试。图26、鼠取肿瘤组织冷冻切片的荧光显微镜观察。图27、小鼠肿瘤检测组织切片利用OleZH2油体检测观察。图28、OleZH2油体靶向型油体治疗的肿瘤负荷鼠_肿瘤变化(尺寸cm3)。图29、OleZH2油体靶向型油体治疗的肿瘤负荷鼠-重量变化(重量千克)。具体实施例方式除非文中另有说明,否则本说明书中(尤其是在权利要求书中)所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式。本发明提供靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体的纳米级人造油体,其组成包含一OleZH2蛋白质,该蛋白质包含一油体膜蛋白及一Zhot2肽;一脂质,该脂质加入所述OleZH2蛋白质后制成OleZH2油体;以及一脂质可包覆药物,称为OleZH2药物油体。本发明利用Zlte2肽与油体膜蛋白(oleosin)结合分子生物技术之后进行简易的制备过程来提供一种人造油体的载体(下文简称为OleZH2油体)。此人造油体可以包覆或镶嵌大量的已知突光信号分子并且能作为生物体内移动的实时(real-time)信号放大器来追踪并确认病灶,或者,用于包覆药物,以作为药物递送体系,再者也能区分油溶性药物的功能。本发明利用基因重组技术将Zlto2肽与油体膜蛋白插入宿主细胞,诱导出OleZH2蛋白质,该油体钙蛋白可以选自以下群组的植物种子的油体蛋白芝麻、橄榄、大豆、花生、麻种子、油菜、葵花、芥花、红花的一部分或其组合;宿主细胞可以为真核宿主细胞及原核宿主细胞,真核宿主细胞选自以下群组单细胞生物体如酵母细胞、源自高等生物体如植物,昆虫或哺乳动物的不死细胞或其组合,原核宿主细胞选自以下群组杆菌、球菌、螺旋菌、弧菌或其组合,最佳为大肠杆菌,、(DE3)、(AG2)或其组合;该脂质可以选自以下群组甘油三酯、橄榄油、芝麻油、大豆油、花生油、矿物油、亚麻油、红花油、或其组合;其中,01以112蛋白质与该脂质的重量/体积比值(微克/微升)为至少约1/25,且该OleZH2油体的平均粒径为纳米等级;通过上述组成,成为具有专一性的递送载体,以提供一主动靶向药物递送体系,由于OleZH2蛋白质中的Zlte2肽可精准地识别癌细胞表面的受体。植物油体是一种中性脂肪分子,主要有三个重要的成分,甘油三酯(TAG)、磷脂质(PL)及油体蛋白,并能够稳定油体结构。而油体蛋白主要有油体膜蛋白(oleosin)及微量的油体I丐蛋白(caleosin)与油体固醇蛋白(steroleosin),如图I所示。本发明是利用01eZH2油体中的01eZH2蛋白质,所包含的油体蛋白为植物种子油体蛋白,但不限于此,植物种子若有油体蛋白都能进行组合,例如芝麻、橄榄、大豆、花生、油菜、葵花、芥花、亚麻、红花(safflower)、及其它植物油体蛋白的组合。而本发明是利用芝麻种子的油体蛋白构建OleZH2蛋白质,而油体膜蛋白质氨基酸序列如SEQIDN0:1所示。对于油体膜蛋白平均大小为100至1,500纳米。本发明作为靶向药物递送体系检测及治疗的纳米级人造油体,其中,OleZH2蛋白质可再包括脂质包覆药物,以分子生物学技术组装成OleZH2药物油体,该药物可以选自以下群组的药物茄红素、姜黄素、喜树碱、抗生素、葫芦素、温诺平(商品名为Navelbin)、紫杉醇(Paclitaxel)、西药、中草药或其组合;或OleZH2蛋白质可再包括脂质包覆药物和脂质包覆已的荧光信号分子,以分子生物学技术并组装成OleZH2荧光药物油体,该药物可以选自以下群组的药物茄红素、姜黄素、喜树碱、抗生素、葫芦素、温诺平、紫杉醇、西药、中草药或其组合;以及,该已知荧光信号分子可以选自以下群组铯化镉量子点(quantumdot)、异硫***酸突光素(FITC)、菌素黄(AlizarineYellowR)、尼罗红(NileRe)或其组合;或OleZH2药物蛋白质可再包括脂质包覆已知荧光信号分子,以分子生物学技术组装成OleZH2荧光药物油体,该已知荧光信号分子可以选自以下群组铯化镉量子点、异硫***酸荧光素、茜素黄、尼罗红或其组合;上述其一,如图2所示。本发明OleZH2油体的OleZH2蛋白质,包含Zlto2肽,使OleZH2油体成为具有专一性的递送载体,又称靶向载体,而且OleZH2油体也能包覆药物组成主动靶向药物递送体系(下文简称为OleZH2药物油体)。而Zlte2肽能精准地识别癌细胞表面的受体,由此可知,油体膜蛋白结合Zlto2肽并且包覆药物的人

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