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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。绿侧花海葵(Anthopleuraanjunae)寡肽制备的关键技术与抗前列腺癌作用研究*??吴宗泽丁国芳①杨最素余方苗唐云平贾盈露郑媛媛陈锐(;)绿侧花海葵(Anthopleuraanjunae)寡肽制备的关键技术与抗前列腺癌作用研究*吴宗泽1,2丁国芳1,2①杨最素1余方苗1唐云平1贾盈露1郑媛媛1陈锐1(;)本文探讨绿侧花海葵(Anthopleuraanjunae)抗前列腺癌酶解寡肽制备与工艺优化。以绿侧花海葵肉为原料进行酶解,筛选最佳蛋白酶,通过正交实验优化酶解条件,并通过超滤、阴离子交换层析、G-25凝胶过滤和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化,通过LC-MS和氨基酸序列测定鉴定寡肽的氨基酸序列,并以MTT法检测产物对前列腺癌细胞系DU-145增殖抑制率,以确定活性最强组分,最后通过倒置显微镜观察纯化肽的抗前列腺癌活性。结果表明,碱性蛋白酶为最佳酶种;工艺条件为:最适料液比1︰5、最适pH=11、最适加酶量2000U/g、最适温度35oC、最适酶解时间6h;经高效液相纯化得到由五个氨基酸组成的绿侧花海葵抗前列腺癌寡肽,其氨基酸序列为:Tyr-Val-Pro-Gly-Pro(AAP-H);倒置显微镜结果显示经AAP-H作用24h后的DU-145细胞具有明显的凋亡形态学特征。结论:采用碱性蛋白酶酶解并通过超滤和色谱分离技术能从绿侧花海葵肉中制备抗肿瘤活性肽;且AAP-H对DU-145细胞的增殖抑制作用呈时间与剂量依赖关系,作用后细胞出现了凋亡的形态学特征。因此,AAP-H能明显抑制前列腺癌细胞DU-145增殖,可以诱导其发生凋亡而发挥抗肿瘤作用。绿侧花海葵;酶解;抗肿瘤;寡肽;工艺前列腺癌(Prostate,PCa)一种早期难被发现、却高危性的疾病,相比欧美国家,我国前列腺癌发病率要低得多,但是近年来由于人们饮食不均衡和环境污染,发病率也呈现明显的上升趋势(景奕文等,2014),并成为威胁我国男性健康的重要因素。前列腺癌的发生发展与宿主免疫系统对肿瘤失去调控有关,如果得不到及时有效的治疗将发展为雄性激素非依赖性前列腺癌,加上晚期骨转移,给治疗带来极大的难度(Michalakietal,2004)。因此,寻找既能提高人体免疫能力又能有效诱导癌细胞凋亡的活性物就显得尤其重要。海葵(seaanemone)属于原始海洋生物,六放珊瑚亚纲的一目,有6科、37种,分布广泛,常见于热带和温带海底岩石和泥沙中(胡波,2011)。目前,各国科学家对海葵***(张均顺等,1998)钾离子通道和钠离子通道活性进行了大量的研究(Rodríguezetal,2014);另外,其降血压(Shkrobetal,2005)、抗真菌、免疫调节(Chietal,2011)和抗肿瘤(Solettietal,2008)的研究也有大量报道。但是由于海葵***含量极少、提取困难,严重制约生理学和病理学方面的研究(Monroy-Estradaetal,2007)。参考海洋生物活性肽的研究进展发现用酶解法制备生物活性肽已经成为新的研究热点,提取得到的活性肽既能补充机体营养成分,又具有抗氧化、抗凝血、降血压、抗肿瘤等活性(张岩等,2012)。据窦光宇(2003)报道,在众多海葵中,数量最多的为绿侧花海葵(Anthopleuraanjunae)。在我国东海部分海域,每平方米绿侧花海葵的数量可达数百个。实验前期调查发现在舟山海域,绿侧花海葵数量庞大,在部分海水养殖区,绿侧花海葵与其它水产品(如贻贝等)形成竞争共生,对水产养殖造成一定的危害。虽然绿侧花海葵资源丰富,但到目前为止,对绿侧花海葵的研究却鲜有报道,而利用酶法开发海葵活性肽尚未见有报道。本实验以绿侧花海葵肉为原料,采用酶解法制备具有抗前列腺癌的活性肽,通过正交实验优化酶解条件,并通过超滤、阴离子交换层析、G-25凝胶过滤层析和高效液相分离纯化,以MTT法检测产物对前列腺癌细胞系DU-145增殖抑制率为指标筛选活性肽;最后通过倒置显微镜观察细胞形态,检验纯化肽的抗前列腺癌活性,旨在为绿侧花海葵抗肿瘤药物和保健品的开发提供参考依据。:采集舟山海域野生海葵,经浙江海洋大学赵盛龙教授鉴定为绿侧花海葵(Anthopleuraanjunae)。碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶:亚太恒信生物科技有限公司;甲醇、乙***:色谱纯,德国默克公司;聚凝***:上海博普生物技术有限公司;F12培养基:美国Gibco公司;无支原体胎牛血清(FBS):杭州四季青生物制品有限公司。CF16RN型高速冷冻离心机、L8900氨基酸自动分析仪:日立仪器有限公司;Agilent-1260型高效液相色谱仪:美国安捷伦公司;ALPHA1-4/LDplus超滤系统:德国默克密理博公司;Forma3111型CO2培养箱:美国Thermo公司;倒置显微镜:日本OLYMPUS公司;酶标仪:美国BioRad科技公司。(李霞等,2004)及营养成分分析(朱春晓等,2011)并稍作修改,取新鲜野生绿侧花海葵置于室温干净海水中养一天,清洗除去杂质。用剪刀从中间剖开后,在大烧杯中加水覆盖,置于–20oC下冷冻12h,室温自然解冻后,反复操作三次。挤出触手毒液,冲洗至得到白色海葵肉。然后高速匀浆(10000r/min,5min),将匀浆液浸泡于异丙醇中去脂,每4h更换一次,连续换3次,再用纯水将异丙醇冲洗干净,置于通风橱中沥干,最后分装标记,置于–20oC保存备用。冻融液参考(Anderluhetal,2002)海葵***的提取方法处理,收集海葵***。-2016测定水分;-2016测灰分;参考GB50095-2016测粗蛋白含量;-2016测定海葵肉的粗脂肪含量。-2016,称取海葵肉匀浆样品经6mol/L盐酸水解后,用日立L8900氨基酸自动分析仪测定氨基酸的组成及含量。,加酶量为1000U/g,根据酶试剂盒上的说明调节最佳pH和温度(表1),置于恒温水浴锅中进行酶解。期间匀速缓慢搅拌,结束后煮沸灭活15min,然后用三层纱布过滤除去粗杂质,滤液在4oC、12000r/min离心10min,连续离心两次。,调节pH=7并对产物进行旋蒸浓缩和冷冻干燥。产物分装置于–20oC冰箱保存备用。-145细胞增殖抑制活性及倒置显微镜观察细胞形态前列腺癌细胞系DU-145用含10%胎牛血清的F12培养液于37oC、5%CO2细胞培养箱中培养,待细胞贴壁生长至70%—80%汇合度时进行传代或实验。MTT法参考张国梅等(2015)并稍作修改,将DU-145细胞接种于96孔板中,设置空白对照组及药物组,药物组加入含不同剂量酶解产物的培养液,每组设3个复孔,培养24h后加入200μL含有10%MTT的PBS缓冲液,并孵育4h。弃MTT培养液,加入DMSO震荡反应,酶标仪检测吸光度A值,计算抑制率(IR),计算公式为:IR=(对照组A值–药物组A值)/对照组A值×100%在六孔板中培养细胞,并按照产物的IC50加药处理24h,倒置显微镜观察细胞形态,分析产物对细胞增殖抑制的原因。,以L16(45)正交实验优化绿侧花海葵抗肿瘤酶解寡肽的制备工艺,以确定最佳的温度、时间、pH、加酶量和料液比,产物经浓缩冷冻干燥并采用MTT法检测对DU-145增殖抑制活性,正交实验的因素和水平如表2所示。,制备绿侧花海葵抗肿瘤寡肽(AnthopleuraanjunaeAnti-tumorPeptide,AAP),用ALPHA1-4/LDplus超滤系统8kDa和20kDa的滤膜分级,并按分子量由小到大命名为AAP-I(MW<8kDa)、AAP-II(8kDa≤MW<20kDa)、AAP-III(MW≥20kDa)。MTT法筛选活性最好组分。-SepharoseFastFlow阴离子交换层析提前活化、平衡交换柱(2cm×35cm),上样浓度为30mg/mL溶液,超声5min,,每次上样3mL,分别以纯水、、、、,各梯度分别洗脱30min,流速为1mL/min,用DBS-100-LCD电脑全自动部分收集器每4min收集一管,于280nm检测吸光度,并根据吸光度曲线合并洗脱峰。产物浓缩冷冻干燥,分装保存于–20oC冰箱中备用。MTT法筛选活性最好组分。-145增殖抑制率最高的AAP-I-1采用G-25凝胶层析继续分离纯化,将样品配制成30mg/mL溶液,超声5min,,每次加3mL到处理好的SephadexG-25层析柱(2cm×50cm),用超纯水洗脱,,用DBS-100-LCD电脑全自动部分收集器每4min收集一管,于280nm检测吸光度,并根据吸光度曲线合并洗脱峰,产物浓缩冷冻干燥。MTT法筛选活性最好组分。-I-1-。进样前平衡Agilent1260ZORBAXSB-C18(×250mm)柱,柱温30oC;洗脱液用乙***超纯水混合液按1mL/min洗脱,0—15min乙***(20%—50%),15—30min:乙***(50%);检测波长为280nm。纯品采用PPSQ-31A蛋白质测序仪测定肽链氨基酸序列。-H活性检测采用倒置显微镜观察AAP-H抗前列腺癌活性。DU-145细胞接种在六孔板中培养至80%—90%的汇合度后加药(1、5和10mg/mL),24h后终止培养,于倒置显微镜下观察并拍照分析。,并采用*±s表示,*表示P<,具有显著性。,含有丰富的粗蛋白占(%)和较低的粗脂肪(%),表明绿侧花海葵是一种高蛋白,低脂肪的海产品。绿侧花海葵肉的氨基酸组成及含量见表4,发现其包含常见的17种氨基酸,种类比较齐全,%,%(朱春晓等,2011);鲜味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸)%,高于太平洋侧花海葵(%),这可能也是绿侧花海葵味道鲜美的原因之一。表3绿侧花海葵肉基础成分分析(g/100g,湿重)(g/100g,wetweight)表4绿侧花海葵肉的氨基酸组成及含量(g/100g,干重)(g/100g,dryweight)根据FAO/WHO对氨基酸评价标准,绿侧花海葵必需氨基酸之间比值与理想的人体氨基酸比值有一定的差异(结果见表5),但研究表明,亲水性多肽(含有Asp、Thr、Ser、Glu、Arg、Lys、His和Gln等亲水性氨基酸)可通过静电吸引方式,特异性作用于肿瘤细胞,导致其细胞膜迅速破裂,细胞内容物渗漏,最终引起肿瘤细胞死亡(谢书越等,2015)。%,亲水性氨基酸的高比例可为今后开发抗癌药物或者功能食品提供依据。-145共同培养24h后,进行MTT活性测试,结果如图1所示。结果发现所有产物的抑制率都表现出剂量依赖性,中剂量(5mg/mL)的胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解产物以及***对DU-145细胞增殖抑制率分别是(±)%、(±)%、(±)%、(±)%和(±)%,对DU-145细胞增殖抑制活性顺序由大到小分别是:***>碱性蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶,所以确定碱性蛋白酶为最优酶种。胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶的酶解产物和***的IC50分别是:、、、。--145细胞形态的影响图2显示不同酶解产物作用24h对前列腺癌DU-145细胞形态的影响,空白对照组细胞生长良好,细胞间排列紧密,细胞形态饱满;经酶解产物作用后,B组到E组细胞之间的间隙增大,细胞膜收缩变圆,并有较多细胞脱离培养瓶壁,即细胞死亡,同时相对空白组细胞数目明显减少;经***作用后的F组细胞出现破碎,被裂解成碎片。虽然无论是***还是酶解产物都能促进DU-145细胞死亡,但是从细胞形态变化初步判断其作用机制不同。海葵***能在细胞上形成特异穿孔,使细胞破碎造成溶解(Marinoetal,2004)。而细胞凋亡的形态特征主要是细胞染色质固缩,凝聚与核边缘,呈块状、环状或者新月状(马岚,2006)。因此初步推断,酶解法制备的活性肽肽很可能是通过诱导细胞凋亡而抑制细胞增殖。、温度、pH值、加酶量和时间5个因素,以IR值作为指标,检测碱性蛋白酶产物抑制前列腺癌细胞DU-145增殖活性的最优条件,结果见表6。采用极差法进行分析,从Rj值大小可以看出,A(料液比)>E(时间)>D(温度)>C(加酶量)>B(pH值)。而IR值最大时的水解条件为A4B4C3D1E3,即料液比为1︰5、pH为11、加酶量为2000U/g、温度为35oC和时间为6h。%±%。