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脂肪,不能沉淀核蛋白及白蛋白,长期用其固定的组织使组织变为酸性,不利于染色,特别是细胞核的着色。经自来水冲洗6~24小时后,可以使其酸碱中和,并减少结晶。(2)4%多聚甲醛:对组织穿透性好,组织收缩小,对大多数抗原物质保存较好,特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。固定的时间不宜太长,以24小时以内为宜,适用于免疫组织化学染色。(3)饱和的苦味酸溶液:能沉淀一切蛋白质,渗透力弱,对组织收缩大,故一般不能单独使用。(4)冰醋酸:渗透力强,沉淀核蛋白,对染色质固定好,使组织膨胀,故一般不单独使用。(5)锇酸:价格昂贵,为强氧化剂,易还原成氢氧化锇,呈黑色沉淀;必须避光保存。不能沉淀蛋白质,而使蛋白质凝胶化,所以对蛋白质固定不均匀,锇酸固定的细胞能保持生活时的形态,不收缩细胞,对胞质固定较长好,核的固定不好,锇酸为脂肪及类脂质的优良固定剂,经它固定的脂肪和类脂质呈黑色,特别是对于是显示线粒体和高难度尔基复合体效果良好。混合固定剂(1)Bouin氏固定液:为常用的良好的固定剂,穿透速度快,组织收缩性较小,固定均匀,固定后组织有适当的硬度,对于切片和染色均有良好的效果。一般固定12~24小时,固定后入70%酒精洗去苦味酸的黄色,在脱水时经各浓度酒精也可洗去黄色,在酒精中加入氨水一滴或少许碳酸钾饱和水溶液,可加快洗去苦味酸的黄色即使留有少量苦味酸的黄色,对一般染色体并无影响。(2)Zenker液():此液多用于一般组织的固定,它能使细胞核、细胞质染色清晰但固定时间长,一般要12~36小时,加热可以缩短固定时间。固定后的组织必须流水冲洗12小时,由于固定中含有升***,在经70%酒精脱水时,加少量的碘液(%碘酒精)以脱***。(3)Carnoy液:渗透力强,特别适宜于固定染色体、肝糖、粘液等一些较为细微的结构。显示DNA、RNA效果良好。(4)改良Bouin氏固定液:此液对一般组织固定效果都很好,固定时间为4~18小时,固定后直接放70%乙醇脱水,固定时间较长对组织亦无损害。(七)???组织块修整固定后的组织块可能会在外部形态上有些改变,或者由于组织在还未固定时就取材,组织器官较软,取材不容易切平。经固定后的组织有一定的硬度,此时就可以做一些修整,但改变不要太大,只是将组织材料切取平整,修掉一些不规则的部位。修整组织块时,手术切片一定要锋利。????????????????????????????????????????四、:洗去渗入组织中的固定液,终止固定。以免影响对组织内结构的观察、分析和研究。?:固定后的组织块的冲洗,一般情况下是置水龙头下以自来水流水冲洗,这样可以使组织中的固定液随时溢出,洗得更干净彻底,有些还需要进行特殊的洗涤。?(1)各种以水配制的固定液如甲醛,都必须用流水冲洗,大块组织一般冲洗24小时,小块组织一般冲洗2—10小时。?(2)固定液为多聚甲醛时,用于免疫组织化学等特殊染色的应将组织投入PB缓冲液中,每60分钟更新洗涤液一次,累计6小时。?(3)固定液为酒精或是酒精混合液,一般不需用水冲洗,其组织块的洗涤应用与固定液浓度相等垢酒精换洗或者直接进行脱水的程序。?(4)用锇酸或含有锇酸的固定液固定的组织,必须用流水彻底冲洗干净。?(5)经含有苦味酸的固定液固定的组织块,无论其固定液是水溶性还是酒精溶性,都应充分冲洗,水溶性固定液固定的组织块一般须冲洗12小时,再进入70%的酒精溶液洗涤,酒精溶性固定液固定的组织块直接进入70%的酒精溶液洗涤,该溶液可以脱掉苦味酸的黄色,但最好从50%酒精开始洗涤。?(6)冲洗好的组织可存放在75%酒精内?五、脱水包埋(一),所以必须把组织中的水分彻底脱除。脱水有利于组织的透明和浸蜡,有利于组织的永久保存。?(1)乙醇:可作固定剂,又可脱水剂,但乙醇与水混合时有较剧烈的物理反应。高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺点,因此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水,而必须经过由高到低的一系列不同浓度的酒精,逐渐取代组织中水分,以保证组织脱水彻底,并避免组织过度收缩和硬化。?(2)***:脱水能力比酒精强,但对组织的收缩更大,在组织学制片中较少使用,多用于病理快速切片,或用于某些组化水解酶的固定。?(3)正丁醇:是较好的脱水兼透明剂,可与酒精及石蜡混合,用于脱水是可先经过各种不同浓度的正丁醇和乙醇混合液,再入正丁醇,进行石蜡包埋时,可先用正丁醇和石蜡等量混合液,然后浸入纯石蜡包埋,正丁醇用于脱水的优点是很少引起组织收缩和脆硬,可替代二甲苯,是很好的脱水剂,但由于价格较贵,不常使用。?(1)乙醇脱水过程50%乙醇???6~8小时?75%乙醇???6~8小时?85%乙醇???3~5小时?95%乙醇???1~2小时?95%乙醇???1~2小时?100%乙醇Ⅰ??1小时?100%乙醇Ⅱ??1小时?(2)***脱水如果是***固定的组织,则不必再经过乙醇,可以用新***更换一次,便直接浸入二甲苯或苯中透明。其他水溶液固定的组织,均按上述乙醇脱水方法脱水,亦可由100%乙醇中移入***继续脱水2~4小时再入二甲苯透明,透明后浸蜡包埋。?(3)正丁醇脱水组织用正丁醇脱水前,先经50%乙醇脱水,然后移入正丁醇和乙醇混合液进行脱水。?50%乙醇???????????????6~12小时?50%乙醇+20%正丁醇+30%蒸馏水????5~8小时?50%乙醇+35%正丁醇+15%蒸馏水????4~6小时?45%乙醇+45%正丁醇+10%蒸馏水????3~5小时?25%乙醇+75%正丁醇?????????2~3小时?25%乙醇+75%正丁醇?????????1~2小时?15%乙醇+85%正丁醇?????????1~2小时?5%乙醇+95%正丁醇??????????1~2小时??100%正丁醇Ⅰ?????????????1小时?100%正丁醇Ⅱ?????????????1小时?:(1)脱水的过程应逐步地而不应骤然地进行,不能操之过急。?(2)脱水的时间应根据组织块的大小和组织的类型而定。?(3)组织块在高浓度,特别是无水乙醇内不能放置的时间太长。无水乙醇吸水能力太强,容易造成组织块的过度硬化,使得切片理组织易碎裂。?(4)在脱水的过程中可以将组织块停留在70%~80%的酒精中。?(5)每次更换新的脱水剂时(组织块从低浓度到高浓度),都要把组织块放在吸水纸上吸干,装组织块的容器也要控干水分,以免将水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中,影响脱水效果。?(6)脱水剂的先择要根据实验的要求及实验室的条件?(二),为下一步的浸蜡起到桥梁作用;?使组织呈现不同程度的透明状态,有利于光线的透过。?(1)二甲苯:是现在应用最广的一种透明剂,价格较便宜,不能和水混合,遇水则变成乳白色浑浊,因此必完全脱水后才能使用;易溶于酒精又能溶解石蜡,透明力强;其最大的缺点是容易使组织收缩变硬变脆,所以组织不能在其停留过久,透明时间视组织块的大小、性质而定;有的组织如肌肉、肌腱、软骨、骨、皮肤、头皮及眼球等,不宜用二甲苯透明,因组织过硬不易切片;长时间接触,对粘膜有刺激作用。?(2)苯:性质与二甲苯相似,对组织收缩也较小,组织也不易变脆,但透明较慢,组织在其内可以滞留12~24小时,但毒性较大。?(3)香柏油:用为透明剂,效果很好,有高度透明作用,能与醇和二甲苯混合,香柏油对组织的硬化及收缩程度比任何其他透明剂都要小,但透明的速度较慢,3mm以下厚度的组织块需12小时以上。香柏油与石蜡不易融合,即香柏油不易被石蜡取代,因此经香柏油透明以后,可经过二甲苯短时间媒浸,再进行石蜡包埋。肌肉、皮肤、血管、膀胱、垂体及肾上腺等用香柏油效果较好。?:两次透明第一次透明约40分钟?第二次时间不一定,要视透明效果而定?(1)时间不宜过长,否则组织会变脆;?(2)组织块脱水必彻底。?(三)浸蜡、包埋(石蜡包埋法)(1)浸蜡的目的置换组织中的透明剂,为包埋做准备。?(2)浸蜡的步骤在60度恒温蜡箱中放置3个蜡杯,分别编号1(52℃~54℃)、2(52℃~54℃,或54℃~56℃)、3(56℃~58℃),其中分别盛软蜡、软蜡、硬蜡,取透明好的组织块放入软蜡中各1小时,迅速取出放入硬蜡,同样放置1小时。如果时间来及包埋,可以将已经完成浸蜡的组织块取出放在温箱外,第二天继续。?(3)注意事项温箱中的温度必须严格控制在60℃的范围,不能超过60℃;浸蜡时间不宜过长。浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆变。(1)步骤