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RT-PCR原理与实验操作步骤.doc

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RT-PCR原理与实验操作步骤.doc

上传人:才艺人生 2024/5/10 文件大小:2.26 MB

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文档介绍:该【RT-PCR原理与实验操作步骤 】是由【才艺人生】上传分享,文档一共【10】页,该文档可以免费在线阅读,需要了解更多关于【RT-PCR原理与实验操作步骤 】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。RT-PCR原理与实验操作步骤RT-PCR原理与实验操作步骤关键词:RT-PCR逆转录酶reversetranscriptase聚合酶链式反应引物设计DNA聚合酶一、知识背景:1、基因表达:DNARNAProtein单拷贝基因表达存在逐步放大机制,如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRNA(每个mRNA存活4d,可以合成105个丝心蛋白)共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。2、PCR技术(olymerasechainreaction):即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应,其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步:A、变性:通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂,形成单链DNA;B、退火:将反应混合液冷却至某一温度,使引物与模板结合。C、延伸:在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2+存在下,退火引物沿5'3'方向延伸。以上三步为一个循环,如此反复。3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶(reversetranscriptase)是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三种活性:1、依赖RNA的DNA聚合酶活性:以RNA为模板合成cDNA第一条链;2、Rnase水解活性:水解RNANA杂合体中的RNA;3、依赖DNA的DNA聚合酶活性:、RT-PCR的准备:1、引物的设计及其原则:1)引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列,同种蛋白的不同亚型,不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。3、匀浆管:5ml4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个5、EP管:、、100μl6、试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖)1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇)7、量筒:50ml、250ml、500ml8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml9、试管架:5ml、、20μl10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水11、铝制饭盒:4个12、塑料小饭盒:1个13、大瓷缸:2个14、锡泊纸:一卷15、卷纸:2卷16、三角烧瓶:带盖,稍大二、实验器具的处理与准备1、塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干)3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC)三、试剂配制:1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。2、75%乙醇:用无水乙醇DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)3、异丙醇:放入棕色瓶中4、***仿:放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制:1、电泳缓冲液:?×TBE(贮存液)再将5×(即工作液浓度),如取50ml贮存液450ml水--→500ml工作缓冲液2、上样缓冲液:%%二甲苯青FF30%甘油6×缓冲液,4℃保存五、琼脂糖凝胶的配制:1、%:,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后现进行电泳。2、%:同上,、需购置的RT-PCR材料:(.)Taq酶(含MgCl2Buffer):1支Oligo(dT)15:-MLV:(Buffer)RNasin:1支110---20℃--4℃Marker:()七、引物合成正义:5′-GGACTCATC-3′反义:5′-AACACAGT-3′2、par-4:正义:5′-TCGGAACTCAAC-3′反义:5′-TGGGACTG-3′3、退火温度计算2(AT)4(GC)正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)4、引物各合成5OD,每OD一瓶分装好5、引物稀释:加DEPC水量为(μl)=?nmol/OD×管上所标OD数×100是为10pmol/μl浓度的引物溶液八、PCR产物电泳先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。九、几个注意点:1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴?2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。3、RNA抽提前,打开离心机预冷。TRIzol法抽提总RNA细胞1×107组织100mg↓加1mlTRIzol细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块↓匀浆(要彻底,后转至EP管)(组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管)↓颠倒混匀10下,室温5分钟↓加***仿1/5体积()(必须按总体积的1/5)颠倒混匀10下,室温5分钟↓4℃,离心12000g,15分钟↓转上层水相(约400μl)↓加等体积异丙醇(约400μl),混匀室温10分钟↓4℃,离心12000g,10分钟↓弃上清↓加冰预冷的75%乙醇(用DEPC水配)1ml↓4℃离心7500g,5分钟↓弃上清,空气干燥5-10分钟(不能完全干燥)↓溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl)(可在55-60℃水中,<10分钟助溶)?注:1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中,否则DEPC溶解2、细胞组织加TRIzol匀浆后,可在-60℃放置至少一个月(甚至可一年以上)3、RNA在75%乙醇中,2-8℃至少可保存一周,-20℃至少可保存一年两步法RT-PCR(第一步:逆转录反应)试剂浓度体积终浓度RNA23μl()Oligo(dT)(2μl)(稀释10倍后用)↓混匀,离心,70℃5min↓立即冰水浴,稍离心↓试剂浓度体积终浓度M-MLVBuffer5×8μl(4μl)1×dNTP10mM2μl(1μl)()20μM-MLV200U/μl2μl(1μl)200U总体积40μl(20μl)↓混匀,离心,42℃60min↓95℃10min(破坏MLV)↓4℃保存两步法RT-PCR(第二步:PCR反应)总体积20μl(50μl)试剂浓度体积终浓度TaqBuffer10×2μl(5μl_)1×(3μl)()<200uM上游引物10pmol/(1μl)10pmol下游引物10pmol/(1μl)10pmolcDNA模板X(?)(1-10μl)DEPC水20μl--X